【摘要】：研究目的鈦及其合金具有優(yōu)良的機(jī)械性能、抗腐蝕性能和生物相容性,是口腔種植體的首選材料。但是鈦表面致密的氧化層使得材料呈現(xiàn)一定的生物惰性,導(dǎo)致其植入體內(nèi)后骨結(jié)合較為緩慢;另外該表面不具有抗菌能力、易粘附細(xì)菌并形成生物膜,進(jìn)而引發(fā)感染或種植體周?chē)?甚至導(dǎo)致治療失敗。故提升材料表面骨結(jié)合能力和賦予表面抗菌能力對(duì)種植體應(yīng)用具有重要價(jià)值。在眾多的鈦表面改性方法中,堿熱處理可通過(guò)調(diào)控表面形貌、化學(xué)組成、親疏水性等影響其生物學(xué)性能,且具有操作簡(jiǎn)單且易控制的特點(diǎn)�？梢詷�(gòu)建出微米級(jí)和納米級(jí)孔復(fù)合的層級(jí)多孔結(jié)構(gòu),同時(shí)表面富含羥基和具有超親水性能,為隨后的生物分子修飾奠定了良好的基礎(chǔ)。仿海洋貽貝粘附性的多巴胺分子具有鄰苯二酚和氨基,其可以1)自身聚合形成具有更多活性反應(yīng)基團(tuán)的聚多巴胺,2)牢固粘附在眾多材料表面改善生物相容性,3)實(shí)現(xiàn)其他生物分子在材料表面的橋連;4)可以螯合甚至還原金屬離子。這些性能使其成為種植體表面改性的重要選擇。在廣譜抗菌劑中,銀具有抗菌能力強(qiáng)、穩(wěn)定性高、不引發(fā)細(xì)菌耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)銀離子相比,納米尺度的銀因尺寸小、比表面積大,具有更強(qiáng)的抗菌能力。本研究通過(guò)在純鈦表面進(jìn)行改性處理,充分利用多孔結(jié)構(gòu)的承載能力和多巴胺的還原能力,期望構(gòu)建出具有良好的骨結(jié)合能力及抗菌性能的多功能涂層,加速種植體植入后的骨結(jié)合,同時(shí)防止種植體周?chē)装Y的發(fā)生,提高種植修復(fù)的成功率。另外,本研究對(duì)光滑表面和多孔表面上構(gòu)建的聚多巴胺-納米銀涂層的性能做了詳細(xì)比較,為種植體設(shè)計(jì)提供理論和技術(shù)支持。研究方法(1)采用堿熱處理的方法,在光滑鈦表面構(gòu)建多孔形貌,然后利用水相多巴胺沉積,在多孔鈦表面沉積聚多巴胺涂層,最后浸沒(méi)于不同pH值的硝酸銀溶液中,利用多巴胺的還原能力在不同酸堿環(huán)境中的多孔鈦表面構(gòu)建聚多巴胺-納米銀涂層。通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)、能量色散譜儀(EDS)、X射線光電子能譜(XPS)進(jìn)行理化性能表征,評(píng)估不同酸堿環(huán)境對(duì)于多巴胺介導(dǎo)納米銀涂層構(gòu)建的影響。(2)在適宜的酸堿環(huán)境中通過(guò)相同的方法將銀離子在光滑鈦表面上也還原為納米銀。通過(guò)FE-SEM、XPS、接觸角測(cè)試儀比較光滑表面和多孔表面構(gòu)建的各步樣品的理化性能及表面潤(rùn)濕性能差別。(3)通過(guò)電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)比較光滑鈦表面和多孔鈦表面聚多巴胺-納米銀涂層中銀離子在礦化液中的釋放行為,以及多孔納米銀涂層中銀離子在礦化液和在去離子水中的釋放行為。(4)通過(guò)活死細(xì)菌熒光染色、抑菌環(huán)試驗(yàn)、濁度法(微生物增殖曲線),考察各制備樣品對(duì)六種口腔常見(jiàn)微生物的抗菌性能,包括革蘭氏陰性菌:大腸桿菌(E.coli和革蘭氏陽(yáng)性菌:金黃色葡萄球菌(S.aureus)、變形鏈球菌(S.mutans)、衣氏放線菌(A.israelii)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)和真菌:白色念珠菌(C.albicans)。(5)通過(guò)將各制備樣品浸泡于仿生礦化液中,模擬樣品植入體內(nèi)后表面性質(zhì)的變化,并通過(guò)FE-SEM和XPS分析各樣品表面礦化后的形貌和化學(xué)成分組成的變化,分析所得涂層是否具備促進(jìn)種植體表面非細(xì)胞介導(dǎo)的成骨潛能。(6)通過(guò)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白熒光染色、MTT法及堿性磷酸酶(ALP)活性,分析各制備樣品表面及納米銀涂層礦化表面對(duì)小鼠胚胎成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)的影響,評(píng)價(jià)樣品表面對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的成骨潛力。研究結(jié)果(1)FE-SEM、EDS、XPS結(jié)果顯示硝酸銀溶液的pH值影響多巴胺介導(dǎo)的納米銀涂層的構(gòu)建,相對(duì)于酸性及中性環(huán)境(pH4、pH7),堿性環(huán)境(pHI0)更利于納米銀的沉積,獲得的納米銀顆粒數(shù)量更多、尺寸更小、分布更均勻。(2)堿熱處理后在光滑鈦表面形成大量開(kāi)放型微納米多孔結(jié)構(gòu),孔壁為大量支柱樣結(jié)構(gòu),支柱的壁厚約30-50nm。隨后在微納米多孔表面和光滑表面均成功構(gòu)建聚多巴胺涂層和聚多巴胺-納米銀涂層。與光滑表面聚多巴胺-納米銀涂層相比,多孔表面的涂層獲得數(shù)目更多、尺寸更小(20-40nm),且形狀更均勻的納米銀顆粒。(3)堿熱處理后的多孔表面水接觸角為25.3±4.1°,較光滑表面(79.0±6.4°)的親水性得到明顯改善;在光滑表面,多巴胺修飾后接觸角為66.5±3.4°,親水性得到改善,但納米銀使表面疏水,接觸角略微增加到72.3±3.5°;多孔表面上,聚多巴胺和納米銀則相繼影響了表面親水性,接觸角分別增加到50.2±5.4°和76.5±6.7°。(4)ICP-OES結(jié)果顯示光滑表面聚多巴胺-納米銀涂層在礦化液中呈現(xiàn)了緩慢下降、較高劑量的銀釋放,而多孔納米銀涂層在礦化液中則呈現(xiàn)為初始階段高劑量釋放、隨后低劑量釋放。30天后光滑表面涂層中和多孔表面涂層中仍然存在0.11±0.05μg和0.09±0.02μg的銀釋放,均顯示出良好的持續(xù)性;多孔納米銀涂層在去離子水中呈現(xiàn)穩(wěn)定的、高劑量的銀釋放,累積釋放曲線近似于線性,同礦化液中銀釋放方式明顯不同。(5)樣品表面活死細(xì)菌熒光染色結(jié)果顯示堿熱處理后的多孔表面相對(duì)于光滑表面更容易受微生物粘附,在納米銀修飾后,無(wú)論是多孔涂層表面還是光滑涂層表面都抑制了六種口腔常見(jiàn)微生物在其上的粘附;抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)顯示納米銀修飾的涂層表面均出現(xiàn)明顯、透明的抑菌環(huán),兩種涂層均可一定范圍內(nèi)抑制周?chē)h(huán)境的微生物增殖;濁度法結(jié)果顯示兩種納米銀修飾的涂層完全抑制了液體環(huán)境中的微生物生長(zhǎng),均獲得了良好、穩(wěn)定的抗菌性能。(6)礦化實(shí)驗(yàn)后FE-SEM、XPS結(jié)果顯示堿熱處理后的多孔表面相對(duì)于光滑表面可以形成更多的礦化產(chǎn)物;聚多巴胺涂層表面的礦化產(chǎn)物最多;多孔表面聚多巴胺-納米銀涂層的礦化產(chǎn)物多于光滑表面聚多巴胺-納米銀涂層,提示多孔納米銀涂層相對(duì)于光滑納米銀涂層具有更高的非細(xì)胞介導(dǎo)的成骨潛能。不同涂層礦化程度跟表面結(jié)構(gòu)及表面暴露聚多巴胺的量有關(guān)。(7)樣品表面細(xì)胞肌動(dòng)蛋白熒光染色結(jié)果顯示納米銀的修飾推遲了成骨細(xì)胞的粘附和鋪展,但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),納米銀涂層表面的成骨細(xì)胞MTT、ALP活性均為上升趨勢(shì)。在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn),多巴胺介導(dǎo)的礦化涂層表面粘附的成骨細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)均優(yōu)于非礦化的涂層表面,MTT、ALP活性同樣高于非礦化納米銀涂層組。此外,相對(duì)于光滑結(jié)構(gòu)的納米銀涂層礦化表面,多孔結(jié)構(gòu)的納米銀涂層礦化表面更有利于成骨細(xì)胞的粘附、增殖和分化,顯示出更理想的細(xì)胞介導(dǎo)的成骨潛力。結(jié)論與意義本研究通過(guò)堿熱處理、水相多巴胺沉積、硝酸銀溶液浸泡,在微納米多孔或光滑的鈦表面上成功構(gòu)建聚多巴胺-納米銀涂層。相對(duì)于酸性及中性環(huán)境,堿性環(huán)境的硝酸銀溶液更利于多巴胺介導(dǎo)的納米銀沉積;而相對(duì)于光滑表面的納米銀涂層,多孔表面上獲得了數(shù)目更多、尺寸更小的納米銀顆粒,且多孔表面暴露了更多的多巴胺,誘導(dǎo)了更多的礦化,這導(dǎo)致多孔表面納米銀涂層初期銀快速釋放后,后期納米銀釋放快速減少。兩種表面構(gòu)建的納米銀涂層都顯著抑制了微生物的粘附與增殖,抗菌性能沒(méi)有明顯差異,證明該修飾涂層解決了多孔表面易發(fā)生感染的問(wèn)題,但納米銀涂層推遲了成骨細(xì)胞的粘附與增殖,而多巴胺介導(dǎo)的礦化改善了表面成骨細(xì)胞相容性,尤其多孔表面納米銀涂層。因此,本研究推測(cè)多孔表面納米銀修飾的涂層材料在植入后初期可以發(fā)揮優(yōu)越的抗菌性能,降低感染風(fēng)險(xiǎn),植入后隨著從體液中逐漸吸附鈣磷元素將快速形成礦化層,進(jìn)一步改善了細(xì)胞相容性并促進(jìn)成骨分化,從而實(shí)現(xiàn)骨結(jié)合,這符合體內(nèi)要求,具有臨床應(yīng)用潛力。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R783.1
【圖文】：

促進(jìn)快速有效的骨結(jié)合是目前種植體表面處理發(fā)展的趨勢(shì)ＦＩ。然而，材料表面不逡逑同的微觀形貌會(huì)產(chǎn)生不同的生物學(xué)響應(yīng)，骨與種植體表面不同尺度上的相互作用逡逑如圖１．２所示【１７］。首先，從生物力學(xué)角度來(lái)看，微米級(jí)表面會(huì)加強(qiáng)分子的轉(zhuǎn)運(yùn)和逡逑促進(jìn)纖維蛋白的吸附及成骨細(xì)胞的遷移納米級(jí)結(jié)構(gòu)影響細(xì)胞的粘附和排列方逡逑式；第二，從物理角度來(lái)看，微米級(jí)形貌在增加材料表面的粗糙度的同時(shí)也大大逡逑增加了材料的表面積，使得種植體與骨組織之間會(huì)形成強(qiáng)烈的生物學(xué)固定［｜９］。而逡逑納米級(jí)的表面形貌更加接近于骨組織的形貌，從而具有更好的仿生學(xué)效應(yīng)可逡逑以更好的模擬細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｍａｔｒｉｘ，邋ＥＣＭ）微環(huán)境口。第三，逡逑從分子觀點(diǎn)來(lái)看，微米級(jí)結(jié)構(gòu)表面存在很多分子信號(hào)假說(shuō)，而納米級(jí)結(jié)構(gòu)表面可逡逑以粘附納米尺寸的信號(hào)傳感器和細(xì)胞受體，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)活性逡逑Ｍａｃｒｏｓｃａｌｅ邐Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ邐Ｎａｎｏｓｃａｌｅ逡逑Ｂｏｎｅ邋Ｉｍｐｌａｎｔ邐Ｃｏｌｌａｇｅｎ邋＆逡逑Ｏｔｈｅｒ邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ逡逑圖１．２在宏觀上，種植體對(duì)骨提供良好的固定。在微觀尺度，微米級(jí)特征可逡逑以與成骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞相互作用；而納米級(jí)特征

植入部位需要盡快恢復(fù)正常機(jī)能，即實(shí)現(xiàn)良好的骨結(jié)合，降低外來(lái)微生物的影響。逡逑從這個(gè)角度而言，種植體良好的骨結(jié)合能力和抗菌能力是相輔相成、相互促進(jìn)的。逡逑１．４聚多巴胺逡逑１．４．１聚多巴胺簡(jiǎn)介逡逑在自然界中，海洋貽貝可以穩(wěn)定的粘附在巖石、船體或其他動(dòng)植物體上，表逡逑現(xiàn)出強(qiáng)大的粘接性能。其原因是貽貝觸角的足腺細(xì)胞可以分泌出一種粘液，主要逡逑成分是貽貝足絲蛋白（＼＾丨丨１＾＜１１１丨丨５１＇0（＾１＇0１0丨１１５，１＼／＾和），它能夠牢固的粘附在各逡逑種物質(zhì)的表面。在該足絲蛋白中存在５種含有３，４－二羥基苯丙氨酸逡逑（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ邋，邋ＤＯＰＡ，多巴）的粘性蛋白，分別是邋ＭｌｆｐｈＭｅｆｐ〕、逡逑Ｍｅｆｐ３、Ｍｅｆｐ４和Ｍｅｆｐ５，其中足絲粘結(jié)界面的位置分布的Ｍｅｆｐ３和Ｍｅｆｐ５中逡逑ＤＯＰＡ含Ｍ較高，且粘結(jié)性能與ＤＯＰＡ的含量成正比Ｍ。ＤＯＰＡ中的鄰苯二酚基逡逑團(tuán)是使其具備粘附能力的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)。逡逑ｕ邐１邋ｓｓｅｅｙｋｇｇｙｙｐｇｎａｙｈｙｈｓｇｇｓｙｈｇ逡逑

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