發(fā)布時間：2020-06-12 21:15

【摘要】：研究背景燒傷和創(chuàng)傷導(dǎo)致的大面積全層皮膚缺損,會引起一系列危及生命的嚴(yán)重后果,因此,快速修復(fù)缺損創(chuàng)面至關(guān)重要。目前,自體刃厚皮膚移植仍是修復(fù)燒傷導(dǎo)致的大面積皮膚缺損的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。大面積燒傷患者自體皮源缺乏,往往需要通過將刃厚皮處理成微粒皮來擴大植皮的擴展比例,但這是以犧牲創(chuàng)面愈合質(zhì)量為代價的。膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的重要組成成分,與合成材料相比,在促進創(chuàng)面愈合方面具有更優(yōu)良的生物特性。目前,膠原蛋白大多是從動物結(jié)締組織提取而來,存在一定的病毒隱患,且成本高產(chǎn)量低。將人類膠原蛋白基因?qū)牖蚬こ叹?通過基因工程技術(shù)獲取的重組人膠原蛋白安全性高,成本低,能大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。此外,重組膠原蛋白增加了親水基團,水溶性提高,可制備出膠原蛋白濃度較高的水凝膠。而水凝膠材料的保水性能又能為創(chuàng)面提供濕潤的愈合環(huán)境,從而加快創(chuàng)面愈合速度,改善愈合質(zhì)量。由于具備優(yōu)良的生物特性,膠原蛋白也是制備人工真皮的主要材料。人工真皮主要用來充當(dāng)真皮修復(fù)過程中引導(dǎo)細胞遷移增殖和膠原排列的支架,幫助完成真皮的重構(gòu)和血管化,可加快創(chuàng)面愈合速度,改善創(chuàng)面愈合后皮膚彈性、柔軟性及機械耐磨性。但目前人工真皮用于全層創(chuàng)面修復(fù)需要經(jīng)過2次手術(shù),增加了病人的痛苦和負擔(dān)。本研究首先以重組人膠原蛋白為原料制備水凝膠并進行相關(guān)性能檢測,并選用以豬肌腱膠原蛋白為原料的皮耐克作為人工真皮的代表,然后將該水凝膠和人工真皮皮耐克兩種膠原材料分別作為微粒皮移植覆蓋物用于修復(fù)大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面,并進行創(chuàng)面愈合速度和愈合質(zhì)量的療效評價。目的本研究擬制備以重組人膠原蛋白為原料的水凝膠,選用以豬肌腱膠原蛋白為原料的皮耐克作為人工真皮的代表,探索該水凝膠和人工真皮皮耐克分別作為微粒皮移植覆蓋物修復(fù)全層皮膚缺損創(chuàng)面的治療效果,為臨床修復(fù)全層皮膚缺損創(chuàng)面提供參考。方法1.重組人膠原蛋白水凝膠的制備及表征1.1以DMEM/F12培養(yǎng)基配制濃度為10%的膠原蛋白溶液,通過海藻酸鹽與Ca2+反應(yīng)交聯(lián)得到膠原蛋白水凝膠;1.2觀察膠原蛋白溶液成膠后的狀態(tài);掃描電鏡觀察水凝膠微觀結(jié)構(gòu);1.3對水凝膠體外溶脹和降解性能進行檢測;1.4將水凝膠包埋在大鼠皮下,觀察體內(nèi)降解速度。2.重組人膠原蛋白水凝膠對部分創(chuàng)面愈合相關(guān)細胞的影響2.1CCK-8法評價水凝膠浸提液對Ha Ca T細胞、人成纖維細胞、HUVEC3種細胞的毒性;2.2細胞劃痕實驗和Transwell實驗評價水凝膠浸提液對3種細胞遷移能力的影響。3.重組人膠原蛋白水凝膠與人工真皮皮耐克作為微粒皮覆蓋物修復(fù)大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面的療效評價3.1創(chuàng)面愈合速度制備SD大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型,移植微粒皮后分別以膠原蛋白水凝膠、人工真皮皮耐克、凡士林紗布作為覆蓋物修復(fù)創(chuàng)面,以凡士林紗布組作為對照,比較創(chuàng)面愈合速度。3.2創(chuàng)面愈合質(zhì)量3.2.1創(chuàng)面真皮層形成術(shù)后第7天,14天,21天,35天進行創(chuàng)面取材。HE和Masson染色比較各組創(chuàng)面真皮層形成情況,并與正常皮膚組織比較;3.2.2創(chuàng)面基底膜形成Ⅳ型膠原蛋白免疫組化染色比較各組創(chuàng)面基底膜形成情況,并與正常皮膚組織比較;3.2.3創(chuàng)面膠原蛋白沉積通過苦味酸天狼猩紅染色、RT-q PCR、WB檢測術(shù)后第35天創(chuàng)面上皮化后各組膠原蛋白沉積情況,并與正常皮膚組織比較;3.2.4創(chuàng)面TGFβ1、TGFβ3、α-SMA的表達通過免疫組化染色、RT-q PCR、WB檢測術(shù)后第35天創(chuàng)面上皮化后各組TGFβ1、TGFβ3、α-SMA的表達情況。3.3促進創(chuàng)面愈合的機制研究3.3.1創(chuàng)面細胞增殖速度Ki67免疫組化染色比較各組創(chuàng)面細胞增殖情況,并與正常皮膚組織比較;3.3.2創(chuàng)面毛細血管新生CD31免疫組化染色比較各組創(chuàng)面毛細血管新生情況;3.3.3創(chuàng)面VEGF的表達通過免疫組化染色、RT-q PCR、WB檢測早期各組創(chuàng)面VEGF表達情況。3.4 HE和Masson染色觀察膠原蛋白水凝膠和人工真皮皮耐克分別作為微粒皮覆蓋物時促進全層創(chuàng)面修復(fù)的過程。結(jié)果1.重組人膠原蛋白水凝膠的制備及表征成功制備出濃度為10%的膠原蛋白水凝膠;電鏡下可觀察到多孔海綿狀結(jié)構(gòu);在60min達到溶脹平衡,最大溶脹度為1800%;在體外5-6天時降解速度最快,7天降解完全;在體內(nèi)5天降解約40%,10天降解約80%,15天降解完全。2.重組人膠原蛋白水凝膠對部分創(chuàng)面愈合相關(guān)細胞的影響水凝膠浸提液對3種細胞毒性作用均較小,可促進Ha Ca T細胞增殖,成纖維細胞存活率在90%以上,HUVEC存活率在70%以上;細胞劃痕實驗和Transwell實驗均證實水凝膠浸提液可促進3種細胞的遷移。3.重組人膠原蛋白水凝膠與人工真皮皮耐克作為微粒皮覆蓋物修復(fù)大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面的療效評價3.1創(chuàng)面愈合速度術(shù)后7天、14天、21天水凝膠和皮耐克覆蓋微粒皮組創(chuàng)面愈合率均高于凡士林紗布組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,水凝膠組與皮耐克組無差異。3.2創(chuàng)面愈合質(zhì)量3.2.1創(chuàng)面真皮層形成術(shù)后21天,水凝膠和皮耐克覆蓋微粒皮組均有真皮組織形成,第35天真皮組織較為成熟,與正常皮膚相近,而凡士林紗布組第35天為致密膠原沉積的瘢痕組織;3.2.2創(chuàng)面基底膜形成術(shù)后21天,水凝膠和皮耐克覆蓋微粒皮組均有連續(xù)的Ⅳ型膠原蛋白陽性基底膜樣結(jié)構(gòu)形成,第35天基底膜逐漸連續(xù),而凡士林紗布組第35天仍無基底膜形成;3.2.3創(chuàng)面膠原蛋白沉積苦味酸天狼猩紅染色、RT-q PCR、WB證實術(shù)后35天,水凝膠和皮耐克覆蓋微粒皮組創(chuàng)面膠原沉積均少于凡士林紗布組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,水凝膠組與皮耐克組無差異;3.2.4創(chuàng)面TGFβ1、TGFβ3、α-SMA的表達免疫組化染色、RT-q PCR、WB證實術(shù)后35天,水凝膠和皮耐克覆蓋微粒皮組創(chuàng)面TGFβ1、α-SMA表達水平均低于凡士林紗布組,TGFβ3表達水平均高于凡士林紗布組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3.3促進創(chuàng)面愈合的機制研究3.3.1創(chuàng)面細胞增殖速度術(shù)后7天、14天、21天水凝膠和皮耐克覆蓋微粒皮組創(chuàng)面Ki67陽性(提示高增殖活性)細胞數(shù)量均高于凡士林紗布組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,水凝膠組與皮耐克組無差異;3.3.2創(chuàng)面毛細血管新生術(shù)后7天,皮耐克覆蓋微粒皮組創(chuàng)面CD31陽性新生毛細血管數(shù)量高于水凝膠組和凡士林紗布組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;3.3.3創(chuàng)面VEGF的表達免疫組化染色、RT-q PCR、WB證實皮耐克覆蓋微粒皮組術(shù)后7天創(chuàng)面VEGF表達水平高于水凝膠組和凡士林紗布組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3.4通過對術(shù)后7天、14天、21天、35天創(chuàng)面HE和Masson染色的動態(tài)觀察證實,水凝膠和皮耐克覆蓋微粒皮組促進創(chuàng)面愈合的速度較凡士林紗布組快。結(jié)論綜合本課題全部研究,我們得到如下結(jié)論:1、成功制備出重組人膠原蛋白水凝膠,具有較好的吸水保水性能和合適的降解速率,且上述性能均可以通過調(diào)節(jié)原料成分比例和交聯(lián)程度進行調(diào)整,制備過程簡單,成本低;2、將水凝膠浸提液作用于Ha Ca T細胞、成纖維細胞、HUVEC,證明其對上述3種細胞的毒性作用均不明顯,還可促進Ha Ca T細胞增殖和上述3種細胞遷移;3、將膠原蛋白水凝膠和人工真皮皮耐克分別作為微粒皮移植覆蓋物修復(fù)大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面,以凡士林紗布作為對照,證明二者均可以加快創(chuàng)面細胞增殖速度、促進早期創(chuàng)面毛細血管新生、促進早期創(chuàng)面VEGF的表達,從而促進創(chuàng)面愈合;促進真皮組織和基底膜形成,從而提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量;降低TGFβ1和α-SMA的表達水平,增高TGFβ3的表達水平,從而預(yù)防創(chuàng)面過度收縮和減輕瘢痕增生。并首次證明人工真皮皮耐克作為微粒皮覆蓋物一步法修復(fù)全層皮膚缺損創(chuàng)面的可行性。綜上所述,本研究制備的膠原蛋白水凝膠,以及將人工真皮皮耐克作為微粒皮覆蓋物一步法修復(fù)全層皮膚缺損創(chuàng)面的治療方法,都為臨床全層皮膚缺損創(chuàng)面的修復(fù)提供了新的思路。
【圖文】：

圖 2-1 水凝膠大體形貌圖 2-2 水凝膠掃描電鏡下結(jié)構(gòu)由圖可見，水凝膠成膠性良好，有一定的物理強度。掃描電鏡下可觀察到水凝膠冷凍干燥后為多孔海綿狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有滲透吸水作用，又能提高創(chuàng)面局部的透氣性[25]。2.水凝膠的溶脹度

- 18 -圖 2-2 水凝膠掃描電鏡下結(jié)構(gòu)由圖可見，水凝膠成膠性良好，有一定的物理強度。掃描電鏡下可觀察到水凝膠冷凍干燥后為多孔海綿狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有滲透吸水作用，又能提高創(chuàng)面局部的透氣性[25]。2.水凝膠的溶脹度溶脹度是反映水凝膠吸水性能的重要指標(biāo)，是水凝膠作為創(chuàng)面敷料的一項重要性能。圖 2-3 是膠原蛋白水凝膠在 37℃浸于 PBS 條件下的溶脹度曲線。水凝膠的溶脹度在前 5min 上升速度最快，迅速達到約 1690%，隨后溶脹速度逐漸變緩，并在 60min內(nèi)趨于平衡，平均最大溶脹度約為 1800%，說明水凝膠具有較好的吸水性能，可在早期迅速吸收創(chuàng)面滲液，后期保水保濕，為創(chuàng)面提供濕潤的愈合環(huán)境，，加速上皮化過程。圖 2-4 是水凝膠達到溶脹平衡時冷凍干燥后在掃描電子顯微鏡下觀察到的結(jié)構(gòu)。從圖中可以看出，達到溶脹平衡時水凝膠的基本結(jié)構(gòu)仍相對完整，由于吸收水分使得內(nèi)部
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R64;R318.08

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本文編號：2710123