【摘要】：研究目的鈦(Ti)及其合金(主要是Ti-6al-4v)因其良好的機(jī)械性、生物相容性和穩(wěn)定性,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。Ti02具有耐腐蝕性并有利于細(xì)胞附著和隨后的細(xì)胞外基質(zhì)沉積,但由于其表面光滑,無(wú)法有效募集宿主細(xì)胞進(jìn)行組織整合,近年來(lái),人們研究了多種鈦種植體表面修飾方法以加快植入體的骨結(jié)合速度,有研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)不同的方法對(duì)TiO2納米管的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,可改變Ti02材料的表面粗糙度,并且表面蛋白質(zhì)或多肽涂層后可以促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。其中,骨涎蛋白的肽片段苯丙氨酸-組氨酸-精氨酸-精氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-丙氨酸Phe-His-Arg-Arg-Ile-Lys-Ala(FHRRIKA)可促進(jìn)人類胚胎干細(xì)胞粘附和自我更新,在Ti02表面涂覆FHRRIKA可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附和成骨分化。為了探究FHRRIKA修飾的Ti02納米管膜對(duì)人成骨細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞的生物活性的影響,分析表面修飾技術(shù)對(duì)設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)新的牙種植體的臨床意義,我們首次對(duì)FHRRIKA修飾的Ti02納米管進(jìn)行了表征,并檢測(cè)修飾表面上人成骨細(xì)胞牙齦成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為,以提高種植體周圍骨結(jié)合的速度。研究方法1.首先分離來(lái)自同一供體牙槽骨成骨細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞,用膠原酶I消化,制備單細(xì)胞懸浮液,在DMEM/F12培養(yǎng)基中分別進(jìn)行體外培養(yǎng)2周(約3-5代)后,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,并將兩種細(xì)胞接種到6孔板培養(yǎng)至融合狀態(tài),然后對(duì)兩種細(xì)胞分別加入成骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化3周,根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明,使用TRIzol提取兩種細(xì)胞的總RNA,并采用RT-PCR方法檢測(cè)兩種細(xì)胞的成骨標(biāo)志物基因的表達(dá)水平,基因分別為Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RunX2)、骨鈣蛋白(osteocalcin,OC)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)和骨涎蛋白(bone sialoprote-in,BSP)等。2.通過(guò)陽(yáng)極氧化法在20V條件下處理薄的鈦箔3小時(shí),制備直徑均勻(100nm)的TiO2納米管層薄膜。將TiO2納米管層浸入1x10-2mol/L3-氨基丙基-三乙氧基硅烷的無(wú)水己烷溶液中2小時(shí)進(jìn)行硅烷化處理,隨后將TiO2納米管層與FHRRIKA肽片段(2mg/cm2)在無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)(1mm)中固定2小時(shí)。然后將熒光素異硫氰酸酯綴合的FHRRIKA肽采用同樣的條件與TiO2納米管層固定,通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)鈦納米管是否成功包被。隨后采用濺射涂布機(jī)涂布和掃描電子顯微鏡觀察陽(yáng)極氧化納米管層和肽固定化后的微觀結(jié)構(gòu)(100,000倍放大成像),并采用倒置光學(xué)原子力顯微鏡系統(tǒng)觀察肽涂覆TiO2納米管層表面的粗糙度,掃描參數(shù):掃描速率為0.5Hz,掃描面積約為1x1μm2,最后使用NanoNavi軟件對(duì)納米管層表面的粗糙度進(jìn)行量化。3.將牙槽骨成骨細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞分別裝載到FHRRIKA修飾的陽(yáng)極氧化TiO2納米管表面,作為實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)以未用FHRRIKA肽修飾的納米管作為對(duì)照組。接種培養(yǎng)4小時(shí)后,分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):1)樣品用磷酸鹽緩沖液沖洗及戊二醛固定后,采用金濺射鍍膜,并用FEI SIRION 200系統(tǒng)成像對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察;2)同樣對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗固定后,先用1%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉,然后使用單克隆抗肌動(dòng)蛋白抗體作為一抗(1:2000),兔抗小鼠異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的抗體作為二抗(1:500)溫育處理后,細(xì)胞核使用DAPI染色,最后將樣品固定在載玻片上并對(duì)兩組細(xì)胞的細(xì)胞骨架中肌動(dòng)蛋白進(jìn)行共焦激光掃描顯微鏡觀察及免疫熒光檢測(cè);3)用磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞后,采用鈣黃綠素和乙啶二聚體分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察活細(xì)胞的比例對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行測(cè)定。此外,在細(xì)胞接種培養(yǎng)的第7天和第14天,對(duì)FHRRIKA肽修飾納米管表面的細(xì)胞進(jìn)行洗滌并裂解,采用活性檢測(cè)法檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)的活性,并通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX2)、骨鈣蛋白(OC),骨橋蛋白(OPN)和骨涎蛋白(BSP)的相關(guān)成骨標(biāo)志物基因的表達(dá)分析細(xì)胞分化情況。實(shí)驗(yàn)最后對(duì)所得結(jié)果采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P0.05作為閾值,并采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)來(lái)比較每個(gè)因變量差異。研究結(jié)果1.實(shí)驗(yàn)成功分離并培養(yǎng)了供體同源的牙槽骨成骨細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞,并進(jìn)行了成骨細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞的鑒定,細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)均顯示為梭形、多邊形或多角形,當(dāng)采用成骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化3周后,von Kossa染色發(fā)現(xiàn),在成骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)礦化基質(zhì)沉積,并檢測(cè)到礦化結(jié)節(jié),在牙齦成纖維細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到礦化。成骨標(biāo)志物RUNX2、骨鈣蛋白(OC),骨橋蛋白(OPN)和骨涎蛋白(BSP)在成骨細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于牙齦成纖維細(xì)胞。2.肽涂層表面包被實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),功能化的Ti02表面顯示出肽濃度依賴性的熒光強(qiáng)度,并且肽濃度穩(wěn)定在1.6mg/cm2,因此我們推斷FHRRIKA肽可穩(wěn)定涂覆在Ti02納米管膜表面。通過(guò)掃描電子顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn),與陽(yáng)極氧化Ti02納米管的表面結(jié)構(gòu)相比,FHRRIKA多肽修飾沒(méi)有改變Ti02納米管膜的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),兩組納米管的直徑均約為100nm。通過(guò)原子力顯微鏡研究數(shù)據(jù)顯示,肽功能化修飾沒(méi)有顯著改變陽(yáng)極氧化納米管層表面的粗糙度,納米管層表面較為均一的納米孔有利于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的結(jié)合。3.通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),成骨細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞均可在FHRRIKA多肽修飾的Ti02陽(yáng)極氧化納米管表面成功附著,但其表面粘附的成骨細(xì)胞數(shù)量約為牙齦成纖維細(xì)胞的2倍,即FHRRIKA修飾可選擇性地富集成骨 細(xì)胞。在FHRRIKA修飾的Ti02納米管表面上,成骨細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞形成良好的組織細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),而在未修飾的納米管表面上細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)相對(duì)混亂。在修飾和未修飾Ti02納米管表面上的兩種細(xì)胞之間未觀察到形態(tài)學(xué)差異。FHRRIKA修飾的納米管表面的附著細(xì)胞數(shù)量比未修飾的納米管表面較多,且修飾表面較多附著的為成骨細(xì)胞,這可能是因?yàn)樵醋怨窍训鞍椎腇HRRIKA基序?qū)Τ晒羌?xì)胞附著具有選擇性。對(duì)分化培養(yǎng)7天和14天的細(xì)胞堿性磷酸酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),FHRRIKA修飾的納米管表面上的成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性比未修飾的納米管表面上的成骨細(xì)胞明顯增高,而在修飾和未修飾的納米管表面上幾乎檢測(cè)不到牙齦成纖維細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。對(duì)成骨標(biāo)志物基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),成骨細(xì)胞的成骨標(biāo)記物表達(dá)水平在分化誘導(dǎo)2周內(nèi)顯著增加。結(jié)論及意義本研究中我們首次成功地將FHRRIKA肽膜涂覆在TiO2納米管表面,FHRRIKA肽修飾可選擇性地富集成骨細(xì)胞并增強(qiáng)其附著能力。FHRRIKA肽修飾涂層促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨活性,促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨和礦化基質(zhì)的沉積,具有促進(jìn)Ti02納米管植入體的骨結(jié)合的潛能,并為種植體設(shè)計(jì)提供新的表面修飾。因此,FHRRIKA涂層可促進(jìn)Ti02納米材料植入物與周圍骨組織結(jié)合,并為臨床設(shè)計(jì)種植體的表面修飾提供新的思路。
【圖文】：
Ａ：倒置相差纖維鏡下成骨細(xì)胞（ｘ邋１00）逡逑Ｔｈｅ邋ｆｉｒｓｔ邋ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ邋ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ邋ａｆｔｅｒ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｆｏｒ邋３邋ｄａｙｓ邋（ｘ邋１００）逡逑圖１為原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察到的生長(zhǎng)情況。從圖逡逑片中可以看出，原代培養(yǎng)３天后可見(jiàn)，原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞多呈梭形、三角形逡逑或星形的不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)飽滿，邊界清晰，表面較光滑。逡逑２９逡逑
圖２成骨細(xì)胞增殖曲線（酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀）逡逑Ｆｉｇ．邋２Ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆｐｒｉｍａｒｙ邋ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ逡逑從圖２可以看出，本次原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞在前１？３天為細(xì)胞生長(zhǎng)潛伏逡逑期，３？７天為細(xì)胞對(duì)數(shù)增殖期，７天后進(jìn)入平臺(tái)期。逡逑１．３．３喊性淲酸酶染色結(jié)果逡逑心．愈Ｗ，卜．：撼；逡逑圖３成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽(yáng)性（ｘ邋１００）逡逑Ｆｉｇ．邋３邋Ａｌｋａｌｉｎｅ邋ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ邋（ｘ邋ｌ00）逡逑由圖３中可以觀察到：染色后成骨細(xì)胞核呈藍(lán)紫色。逡逑３０逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R783.1
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本文編號(hào)：2709099
