【摘要】：研究目的鈦(Ti)及其合金(主要是Ti-6al-4v)因其良好的機械性、生物相容性和穩(wěn)定性,被廣泛應用于醫(yī)學領域中。Ti02具有耐腐蝕性并有利于細胞附著和隨后的細胞外基質沉積,但由于其表面光滑,無法有效募集宿主細胞進行組織整合,近年來,人們研究了多種鈦種植體表面修飾方法以加快植入體的骨結合速度,有研究發(fā)現,通過不同的方法對TiO2納米管的表面結構進行修飾,可改變Ti02材料的表面粗糙度,并且表面蛋白質或多肽涂層后可以促進細胞的粘附和生長。其中,骨涎蛋白的肽片段苯丙氨酸-組氨酸-精氨酸-精氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-丙氨酸Phe-His-Arg-Arg-Ile-Lys-Ala(FHRRIKA)可促進人類胚胎干細胞粘附和自我更新,在Ti02表面涂覆FHRRIKA可誘導間充質干細胞的粘附和成骨分化。為了探究FHRRIKA修飾的Ti02納米管膜對人成骨細胞和牙齦成纖維細胞的生物活性的影響,分析表面修飾技術對設計和開發(fā)新的牙種植體的臨床意義,我們首次對FHRRIKA修飾的Ti02納米管進行了表征,并檢測修飾表面上人成骨細胞牙齦成纖維細胞的生物學行為,以提高種植體周圍骨結合的速度。研究方法1.首先分離來自同一供體牙槽骨成骨細胞和牙齦成纖維細胞,用膠原酶I消化,制備單細胞懸浮液,在DMEM/F12培養(yǎng)基中分別進行體外培養(yǎng)2周(約3-5代)后,用胰蛋白酶消化細胞,并將兩種細胞接種到6孔板培養(yǎng)至融合狀態(tài),然后對兩種細胞分別加入成骨分化培養(yǎng)基誘導分化3周,根據試劑盒操作說明,使用TRIzol提取兩種細胞的總RNA,并采用RT-PCR方法檢測兩種細胞的成骨標志物基因的表達水平,基因分別為Runt相關轉錄因子(RunX2)、骨鈣蛋白(osteocalcin,OC)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)和骨涎蛋白(bone sialoprote-in,BSP)等。2.通過陽極氧化法在20V條件下處理薄的鈦箔3小時,制備直徑均勻(100nm)的TiO2納米管層薄膜。將TiO2納米管層浸入1x10-2mol/L3-氨基丙基-三乙氧基硅烷的無水己烷溶液中2小時進行硅烷化處理,隨后將TiO2納米管層與FHRRIKA肽片段(2mg/cm2)在無水二甲基甲酰胺(DMF)(1mm)中固定2小時。然后將熒光素異硫氰酸酯綴合的FHRRIKA肽采用同樣的條件與TiO2納米管層固定,通過熒光顯微鏡檢測鈦納米管是否成功包被。隨后采用濺射涂布機涂布和掃描電子顯微鏡觀察陽極氧化納米管層和肽固定化后的微觀結構(100,000倍放大成像),并采用倒置光學原子力顯微鏡系統觀察肽涂覆TiO2納米管層表面的粗糙度,掃描參數:掃描速率為0.5Hz,掃描面積約為1x1μm2,最后使用NanoNavi軟件對納米管層表面的粗糙度進行量化。3.將牙槽骨成骨細胞和牙齦成纖維細胞分別裝載到FHRRIKA修飾的陽極氧化TiO2納米管表面,作為實驗組。同時以未用FHRRIKA肽修飾的納米管作為對照組。接種培養(yǎng)4小時后,分別進行以下實驗:1)樣品用磷酸鹽緩沖液沖洗及戊二醛固定后,采用金濺射鍍膜,并用FEI SIRION 200系統成像對細胞形態(tài)進行觀察;2)同樣對細胞進行沖洗固定后,先用1%牛血清白蛋白進行封閉,然后使用單克隆抗肌動蛋白抗體作為一抗(1:2000),兔抗小鼠異硫氰酸熒光素偶聯的抗體作為二抗(1:500)溫育處理后,細胞核使用DAPI染色,最后將樣品固定在載玻片上并對兩組細胞的細胞骨架中肌動蛋白進行共焦激光掃描顯微鏡觀察及免疫熒光檢測;3)用磷酸鹽緩沖液沖洗細胞后,采用鈣黃綠素和乙啶二聚體分別對細胞進行染色,通過在熒光顯微鏡下觀察活細胞的比例對細胞活力進行測定。此外,在細胞接種培養(yǎng)的第7天和第14天,對FHRRIKA肽修飾納米管表面的細胞進行洗滌并裂解,采用活性檢測法檢測堿性磷酸酶(ALP)的活性,并通過RT-PCR方法檢測Runt相關轉錄因子(RUNX2)、骨鈣蛋白(OC),骨橋蛋白(OPN)和骨涎蛋白(BSP)的相關成骨標志物基因的表達分析細胞分化情況。實驗最后對所得結果采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。數據以平均值標準差表示。以P0.05作為閾值,并采用配對樣本t檢驗來比較每個因變量差異。研究結果1.實驗成功分離并培養(yǎng)了供體同源的牙槽骨成骨細胞和牙齦成纖維細胞,并進行了成骨細胞和牙齦成纖維細胞的鑒定,細胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)時均顯示為梭形、多邊形或多角形,當采用成骨分化培養(yǎng)基誘導分化3周后,von Kossa染色發(fā)現,在成骨細胞中發(fā)現礦化基質沉積,并檢測到礦化結節(jié),在牙齦成纖維細胞中幾乎檢測不到礦化。成骨標志物RUNX2、骨鈣蛋白(OC),骨橋蛋白(OPN)和骨涎蛋白(BSP)在成骨細胞中的表達顯著高于牙齦成纖維細胞。2.肽涂層表面包被實驗發(fā)現,功能化的Ti02表面顯示出肽濃度依賴性的熒光強度,并且肽濃度穩(wěn)定在1.6mg/cm2,因此我們推斷FHRRIKA肽可穩(wěn)定涂覆在Ti02納米管膜表面。通過掃描電子顯微鏡檢查發(fā)現,與陽極氧化Ti02納米管的表面結構相比,FHRRIKA多肽修飾沒有改變Ti02納米管膜的表面拓撲結構,兩組納米管的直徑均約為100nm。通過原子力顯微鏡研究數據顯示,肽功能化修飾沒有顯著改變陽極氧化納米管層表面的粗糙度,納米管層表面較為均一的納米孔有利于細胞外基質蛋白的結合。3.通過掃描電鏡觀察發(fā)現,成骨細胞和牙齦成纖維細胞均可在FHRRIKA多肽修飾的Ti02陽極氧化納米管表面成功附著,但其表面粘附的成骨細胞數量約為牙齦成纖維細胞的2倍,即FHRRIKA修飾可選擇性地富集成骨 細胞。在FHRRIKA修飾的Ti02納米管表面上,成骨細胞和牙齦成纖維細胞形成良好的組織細胞骨架結構,而在未修飾的納米管表面上細胞骨架結構相對混亂。在修飾和未修飾Ti02納米管表面上的兩種細胞之間未觀察到形態(tài)學差異。FHRRIKA修飾的納米管表面的附著細胞數量比未修飾的納米管表面較多,且修飾表面較多附著的為成骨細胞,這可能是因為源自骨涎蛋白的FHRRIKA基序對成骨細胞附著具有選擇性。對分化培養(yǎng)7天和14天的細胞堿性磷酸酶活性檢測發(fā)現,FHRRIKA修飾的納米管表面上的成骨細胞的堿性磷酸酶活性比未修飾的納米管表面上的成骨細胞明顯增高,而在修飾和未修飾的納米管表面上幾乎檢測不到牙齦成纖維細胞的堿性磷酸酶活性。對成骨標志物基因表達分析發(fā)現,成骨細胞的成骨標記物表達水平在分化誘導2周內顯著增加。結論及意義本研究中我們首次成功地將FHRRIKA肽膜涂覆在TiO2納米管表面,FHRRIKA肽修飾可選擇性地富集成骨細胞并增強其附著能力。FHRRIKA肽修飾涂層促進成骨細胞的成骨活性,促進成骨細胞的成骨和礦化基質的沉積,具有促進Ti02納米管植入體的骨結合的潛能,并為種植體設計提供新的表面修飾。因此,FHRRIKA涂層可促進Ti02納米材料植入物與周圍骨組織結合,并為臨床設計種植體的表面修飾提供新的思路。
【圖文】：

Ａ：倒置相差纖維鏡下成骨細胞（ｘ邋１00）逡逑Ｔｈｅ邋ｆｉｒｓｔ邋ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ邋ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ邋ａｆｔｅｒ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｆｏｒ邋３邋ｄａｙｓ邋（ｘ邋１００）逡逑圖１為原代培養(yǎng)的成骨細胞在倒置相差顯微鏡下觀察到的生長情況。從圖逡逑片中可以看出，原代培養(yǎng)３天后可見，原代培養(yǎng)的成骨細胞多呈梭形、三角形逡逑或星形的不規(guī)則形態(tài)，細胞形態(tài)飽滿，邊界清晰，表面較光滑。逡逑２９逡逑

圖２成骨細胞增殖曲線（酶聯免疫檢測儀）逡逑Ｆｉｇ．邋２Ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆｐｒｉｍａｒｙ邋ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ逡逑從圖２可以看出，本次原代培養(yǎng)的成骨細胞在前１？３天為細胞生長潛伏逡逑期，３？７天為細胞對數增殖期，７天后進入平臺期。逡逑１．３．３喊性淲酸酶染色結果逡逑心．愈Ｗ，卜．：撼；逡逑圖３成骨細胞堿性磷酸酶染色陽性（ｘ邋１００）逡逑Ｆｉｇ．邋３邋Ａｌｋａｌｉｎｅ邋ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ邋（ｘ邋ｌ00）逡逑由圖３中可以觀察到：染色后成骨細胞核呈藍紫色。逡逑３０逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R783.1

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本文編號：2709099