【摘要】：目的:因創(chuàng)傷、感染、腫瘤等疾病造成的骨缺損,面臨龐大的臨床修復需求。組織工程骨作為一種新型骨修復材料,受到了廣泛的關注,但實際應用還存在兩大難題:一是從自體提取的骨髓間充質干細胞增殖、分化效率低,難以用作組織工程的種子細胞;二是骨組織工程支架提倡模仿天然骨組織的形態(tài)結構,但目前尚無公認的模仿天然骨組織的仿生支架結構。本研究設計、制備三種不同結構的仿生支架,并通過體外生物相容性檢測進行篩選。為提高增殖能力,本研究通過Sirt3轉染骨髓間充質干細胞,提高細胞的氧化磷酸化水平,從而促進細胞的增殖與分化。進而將細胞/支架復合體植入大鼠顱骨缺損部位,評價體內成骨能力。旨在提供適宜體外細胞富集的仿生支架模型,并構建具有快速增殖分化能力的骨組織工程種子細胞株,為利用組織工程方法進行骨缺損修復提供新的思路和方法。方法:(1)利用參數(shù)化建模設計仿生支架的三維模型。通過水熱法制備β-磷酸三鈣(β-TCP)粉體并利用3D打印制備該仿生支架和0°/90°結構網(wǎng)格支架,通過磷酸二氫銨二次煅燒法制備天然松質骨結構支架。進行紅外光譜、X射線衍射分析三種支架的理化性能表征,進行Micro-CT掃描重建、掃描電鏡、壓縮實驗分析三種支架的結構表征。(2)分離、培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質干細胞,通過Giemsa染色、流式細胞術鑒定細胞后進行細胞/支架共培養(yǎng),活/死細胞染色、DNA含量檢測評價細胞在三種支架上增殖和粘附的效果,更換成骨誘導培養(yǎng)基后進行堿性磷酸酶活性和RT-PCR檢測成骨相關基因表達檢測,探究三種支架結構對細胞增殖、粘附、成骨分化的影響,綜合實驗指標選取體外生物相容性最優(yōu)的一種支架結構。(3)構建pcDNA3.1-Sirt3真核表達載體,將Sirt3基因轉染到SD大鼠骨髓間充質干細胞,并利用熒光顯微鏡、Western Blot檢測蛋白表達,用相應試劑盒檢測細胞耗氧量、ATP生成量、關鍵代謝酶活性上的變化。將細胞附著在仿生支架上,分別利用MTT法和RT-PCR檢測細胞增殖和成骨相關基因表達水平的變化。(4)手術構建了 SD大鼠顱骨6.0mm直徑圓形缺損動物模型,分別植入成骨誘導后,復合了 Sirt3轉染骨髓間充質干細胞和正常骨髓間充質干細胞的β-磷酸三鈣仿生支架。于植入后4周、8周分別進行Micro-CT掃描重建和免疫組織化學染色,評價體內骨修復效果。結果:水熱法制備的粉體與鍛燒法處理的牛股骨余物經(jīng)檢測同為β-磷酸三鈣。3D打印制備的仿生支架具有較高的壓縮模量、孔隙率和表面積。同時仿生支架上接種SD大鼠骨髓間充質干細胞表現(xiàn)出了良好的體外生物相容性。通過脂質體介導轉染SD大鼠骨髓間充質細胞穩(wěn)定表達Sirt3基因,轉染后細胞的氧消耗增加,ATP生成增多,相關代謝酶活力旺盛,細胞增殖、分化速率顯著提高。將Sirt3轉染骨髓間充質干細胞/β-磷酸三鈣仿生支架復合物植入SD大鼠顱骨缺損區(qū)域8周后,Micro-CT和免疫組化結果顯示有明顯新骨組織生成。結論：通過三維建模設計和3D打印制備的仿生支架具有良好的細胞相容性。Sirt3轉染骨髓間充質干細胞使細胞氧化磷酸化水平顯著提高,促進了細胞的增殖和分化。Sirt3轉染骨髓間充質干細胞/β-磷酸三鈣仿生支架復合物在體內植入后骨再生效果良好。本研究構建的新型仿生支架結構有望作為組織工程支架模版用于骨缺損修復,同時Sirt3基因有望用于構建快速增殖分化的自體骨髓間充質干細胞株,作為組織工程的種子細胞。
【圖文】：

具體建模方法如下：首先，設定支架的形狀和邊長輪廓，由此得知支架的逡逑總體積（ＴＶ），通過Ｐｏｐｕｌａｔｅ邋３Ｄ指令在支架內設定隨機分布的點，代表支架內逡逑的微孔（ＭＰ），點的數(shù)量可通過Ｎｕｍｂｅｒ邋Ｓｌｉｄｅｒ指令進行增減（圖２－２－Ａ）；通逡逑過Ｖｏｒｏｎｏｉ邋３Ｄ指令，在支架中微孔的周圍生成若干個圍繞微孔的平面（圖２－２－Ｂ）；逡逑對每兩個平面相交除線段進行賦值，將這些線段轉化為具有體積的棱柱（圖逡逑２－２－Ｃ）；去除支架內的平面參數(shù)和點參數(shù)，保留棱柱，形成支架的骨架結構（圖逡逑２－２－Ｄ）；通過Ｗｅａｖｅｒｂｉｒｄ’ｓＬｏｏｐ指令，對支架骨架結構進行變軟柔化，增大支逡逑架的內部表面積（圖２－２－Ｅ）；保存支架模型并導出為ＳＴＬ格式（圖２－２－Ｆ）。逡逑１５逡逑

＿＇＿＿ｉ＿？逡逑圖２－１邋２Ｄ－Ｖｏｒｏｎｏｉ算法示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋Ｖｏｒｏｎｏｉ邋ａｌｇｏｒｉｔｈｍ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ逡逑具體建模方法如下：首先，，設定支架的形狀和邊長輪廓，由此得知支架的逡逑總體積（ＴＶ），通過Ｐｏｐｕｌａｔｅ邋３Ｄ指令在支架內設定隨機分布的點，代表支架內逡逑的微孔（ＭＰ），點的數(shù)量可通過Ｎｕｍｂｅｒ邋Ｓｌｉｄｅｒ指令進行增減（圖２－２－Ａ）；通逡逑過Ｖｏｒｏｎｏｉ邋３Ｄ指令，在支架中微孔的周圍生成若干個圍繞微孔的平面（圖２－２－Ｂ）；逡逑對每兩個平面相交除線段進行賦值，將這些線段轉化為具有體積的棱柱（圖逡逑２－２－Ｃ）；去除支架內的平面參數(shù)和點參數(shù)，保留棱柱，形成支架的骨架結構（圖逡逑２－２－Ｄ）；通過Ｗｅａｖｅｒｂｉｒｄ’ｓＬｏｏｐ指令，對支架骨架結構進行變軟柔化，增大支逡逑架的內部表面積（圖２－２－Ｅ）；保存支架模型并導出為ＳＴＬ格式（圖２－２－Ｆ）。逡逑１５逡逑
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

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本文編號：2707814