【摘要】：目的:因創(chuàng)傷、感染、腫瘤等疾病造成的骨缺損,面臨龐大的臨床修復(fù)需求。組織工程骨作為一種新型骨修復(fù)材料,受到了廣泛的關(guān)注,但實(shí)際應(yīng)用還存在兩大難題:一是從自體提取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化效率低,難以用作組織工程的種子細(xì)胞;二是骨組織工程支架提倡模仿天然骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu),但目前尚無公認(rèn)的模仿天然骨組織的仿生支架結(jié)構(gòu)。本研究設(shè)計(jì)、制備三種不同結(jié)構(gòu)的仿生支架,并通過體外生物相容性檢測進(jìn)行篩選。為提高增殖能力,本研究通過Sirt3轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,提高細(xì)胞的氧化磷酸化水平,從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化。進(jìn)而將細(xì)胞/支架復(fù)合體植入大鼠顱骨缺損部位,評價體內(nèi)成骨能力。旨在提供適宜體外細(xì)胞富集的仿生支架模型,并構(gòu)建具有快速增殖分化能力的骨組織工程種子細(xì)胞株,為利用組織工程方法進(jìn)行骨缺損修復(fù)提供新的思路和方法。方法:(1)利用參數(shù)化建模設(shè)計(jì)仿生支架的三維模型。通過水熱法制備β-磷酸三鈣(β-TCP)粉體并利用3D打印制備該仿生支架和0°/90°結(jié)構(gòu)網(wǎng)格支架,通過磷酸二氫銨二次煅燒法制備天然松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)支架。進(jìn)行紅外光譜、X射線衍射分析三種支架的理化性能表征,進(jìn)行Micro-CT掃描重建、掃描電鏡、壓縮實(shí)驗(yàn)分析三種支架的結(jié)構(gòu)表征。(2)分離、培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,通過Giemsa染色、流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞/支架共培養(yǎng),活/死細(xì)胞染色、DNA含量檢測評價細(xì)胞在三種支架上增殖和粘附的效果,更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基后進(jìn)行堿性磷酸酶活性和RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因表達(dá)檢測,探究三種支架結(jié)構(gòu)對細(xì)胞增殖、粘附、成骨分化的影響,綜合實(shí)驗(yàn)指標(biāo)選取體外生物相容性最優(yōu)的一種支架結(jié)構(gòu)。(3)構(gòu)建pcDNA3.1-Sirt3真核表達(dá)載體,將Sirt3基因轉(zhuǎn)染到SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并利用熒光顯微鏡、Western Blot檢測蛋白表達(dá),用相應(yīng)試劑盒檢測細(xì)胞耗氧量、ATP生成量、關(guān)鍵代謝酶活性上的變化。將細(xì)胞附著在仿生支架上,分別利用MTT法和RT-PCR檢測細(xì)胞增殖和成骨相關(guān)基因表達(dá)水平的變化。(4)手術(shù)構(gòu)建了 SD大鼠顱骨6.0mm直徑圓形缺損動物模型,分別植入成骨誘導(dǎo)后,復(fù)合了 Sirt3轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和正常骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的β-磷酸三鈣仿生支架。于植入后4周、8周分別進(jìn)行Micro-CT掃描重建和免疫組織化學(xué)染色,評價體內(nèi)骨修復(fù)效果。結(jié)果:水熱法制備的粉體與鍛燒法處理的牛股骨余物經(jīng)檢測同為β-磷酸三鈣。3D打印制備的仿生支架具有較高的壓縮模量、孔隙率和表面積。同時仿生支架上接種SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出了良好的體外生物相容性。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染SD大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)Sirt3基因,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的氧消耗增加,ATP生成增多,相關(guān)代謝酶活力旺盛,細(xì)胞增殖、分化速率顯著提高。將Sirt3轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/β-磷酸三鈣仿生支架復(fù)合物植入SD大鼠顱骨缺損區(qū)域8周后,Micro-CT和免疫組化結(jié)果顯示有明顯新骨組織生成。結(jié)論：通過三維建模設(shè)計(jì)和3D打印制備的仿生支架具有良好的細(xì)胞相容性。Sirt3轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞使細(xì)胞氧化磷酸化水平顯著提高,促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和分化。Sirt3轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/β-磷酸三鈣仿生支架復(fù)合物在體內(nèi)植入后骨再生效果良好。本研究構(gòu)建的新型仿生支架結(jié)構(gòu)有望作為組織工程支架模版用于骨缺損修復(fù),同時Sirt3基因有望用于構(gòu)建快速增殖分化的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株,作為組織工程的種子細(xì)胞。
【圖文】：

具體建模方法如下：首先，設(shè)定支架的形狀和邊長輪廓，由此得知支架的逡逑總體積（ＴＶ），通過Ｐｏｐｕｌａｔｅ邋３Ｄ指令在支架內(nèi)設(shè)定隨機(jī)分布的點(diǎn)，代表支架內(nèi)逡逑的微孔（ＭＰ），點(diǎn)的數(shù)量可通過Ｎｕｍｂｅｒ邋Ｓｌｉｄｅｒ指令進(jìn)行增減（圖２－２－Ａ）；通逡逑過Ｖｏｒｏｎｏｉ邋３Ｄ指令，在支架中微孔的周圍生成若干個圍繞微孔的平面（圖２－２－Ｂ）；逡逑對每兩個平面相交除線段進(jìn)行賦值，將這些線段轉(zhuǎn)化為具有體積的棱柱（圖逡逑２－２－Ｃ）；去除支架內(nèi)的平面參數(shù)和點(diǎn)參數(shù)，保留棱柱，形成支架的骨架結(jié)構(gòu)（圖逡逑２－２－Ｄ）；通過Ｗｅａｖｅｒｂｉｒｄ’ｓＬｏｏｐ指令，對支架骨架結(jié)構(gòu)進(jìn)行變軟柔化，增大支逡逑架的內(nèi)部表面積（圖２－２－Ｅ）；保存支架模型并導(dǎo)出為ＳＴＬ格式（圖２－２－Ｆ）。逡逑１５逡逑

＿＇＿＿ｉ＿？逡逑圖２－１邋２Ｄ－Ｖｏｒｏｎｏｉ算法示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋Ｖｏｒｏｎｏｉ邋ａｌｇｏｒｉｔｈｍ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ逡逑具體建模方法如下：首先，，設(shè)定支架的形狀和邊長輪廓，由此得知支架的逡逑總體積（ＴＶ），通過Ｐｏｐｕｌａｔｅ邋３Ｄ指令在支架內(nèi)設(shè)定隨機(jī)分布的點(diǎn)，代表支架內(nèi)逡逑的微孔（ＭＰ），點(diǎn)的數(shù)量可通過Ｎｕｍｂｅｒ邋Ｓｌｉｄｅｒ指令進(jìn)行增減（圖２－２－Ａ）；通逡逑過Ｖｏｒｏｎｏｉ邋３Ｄ指令，在支架中微孔的周圍生成若干個圍繞微孔的平面（圖２－２－Ｂ）；逡逑對每兩個平面相交除線段進(jìn)行賦值，將這些線段轉(zhuǎn)化為具有體積的棱柱（圖逡逑２－２－Ｃ）；去除支架內(nèi)的平面參數(shù)和點(diǎn)參數(shù)，保留棱柱，形成支架的骨架結(jié)構(gòu)（圖逡逑２－２－Ｄ）；通過Ｗｅａｖｅｒｂｉｒｄ’ｓＬｏｏｐ指令，對支架骨架結(jié)構(gòu)進(jìn)行變軟柔化，增大支逡逑架的內(nèi)部表面積（圖２－２－Ｅ）；保存支架模型并導(dǎo)出為ＳＴＬ格式（圖２－２－Ｆ）。逡逑１５逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2707814