【摘要】：轉錄因子(Transcription factors,TFs)是細胞中的一類調控蛋白,是細胞信號轉導的最終效應器,它們通過與基因中的轉錄調節(jié)區(qū)結合,控制基因的表達,從而調控細胞的生長與分化。目前,已知的TFs已經(jīng)有大約1500種,研究表明TFs異常表達與人類疾病有著密切的關系。例如,核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)被證實在大量病毒感染、腫瘤病例中發(fā)生上調;調節(jié)抑癌基因的p53蛋白在超過50%的腫瘤中失活;調控雌激素基因表達的雌激素受體(Estrogen receptor,ER)在乳腺癌、子宮內膜癌、精神疾病中均有異常表達。因此,TFs不僅是潛在的診斷標志物,也是治療的靶點和藥物研究靶標。正是由于TFs的重要地位,使得對TFs的高效檢測具有重要的意義,但是目前能夠同時滿足高效、高靈敏、低成本的檢測方法仍然缺乏。本文針對TFs的檢測,以DNA-銀納米簇(DNA-silver nanoclusters,DNA-AgNCs)為納米分析元件,從酶輔助信號放大、納米復合體系、變構探針三個角度,研究了TFs傳感分析體系,并將這些體系應用于TFs的生物樣品檢測,以及TFs抑制劑的篩選。各章內容概括如下:第一章基于DNA-銀納米簇與核酸外切酶III輔助信號放大的轉錄因子檢測方法本章中,我們設計合成了DNA-AgNCs分子信標(DNA-AgNCs molecular beacons,AgMBs),并基于AgMBs與核酸外切酶III(Exonuclease III,Exo III)輔助的信號放大技術,開發(fā)了免標記(Label-free)的TFs熒光傳感系統(tǒng)。通過Exo III的酶切作用,我們將TFs與對應雙鏈結合序列的結合過程轉化為一段單鏈DNA(reporter)的釋放,然后AgMBs與Exo III共同作用實現(xiàn)對reporter的信號放大地檢測。AgMBs中用以調控熒光信號增強的富含鳥嘌呤的增強序列(GRS)是一段未經(jīng)修飾的DNA,為Exo III輔助的信號放大提供了原理基礎,這也是AgMBs首次被用于信號放大系統(tǒng)。該傳感系統(tǒng)能夠對細胞核蛋白提取物中NF-κB p50進行定量檢測,檢測限為10 pM(S/N=3),并能用于該TFs靶向抑制劑的評價與篩選。進一步的,通過改變dsDNA的結合序列,該系統(tǒng)能夠用于分析多種TFs,具有較好的普適性。第二章基于DNA-銀納米簇/聚吡咯納米粒復合納米材料的多通路轉錄因子熒光檢測方法本章研究中,發(fā)卡狀的DNA-AgNCs與聚吡咯納米粒(Polypyrrole nanoparticles,PPyNPs)通過非共價作用相互吸附構建復合納米材料DNAAgNCs/PPyNPs,并被用于TFs的檢測。DNA-AgNCs通過單鏈的環(huán)部分吸附在PPyNPs的表面,導致DNA-AgNCs與PPyNPs相互接近而產生能量轉移,導致熒光猝滅。加入目標TFs后,TFs與發(fā)卡狀DNA-AgNCs的雙鏈的莖部位結合,引發(fā)空間位阻效應驅使DNA-AgNCs從PPyNPs的表面解吸附,導致熒光恢復�；赑PyNPs的低非特異性蛋白吸附性質,本方法與已有的基于空間位阻效應的TFs檢測平臺相比靈敏度獲得了顯著提升,對NF-κB p50的檢測限為70 pM(S/N=3),對p53的檢測限為110 pM(S/N=3)。進一步的,利用DNA-AgNCs熒光可調控的性質,設計了兩種具有不同熒光性質并能夠分別識別不同TFs的DNAAgNCs,實現(xiàn)了對NF-κB p50于p53的熒光多通路檢測。本章的研究通過結合DNA-AgNCs與PPyNPs的特點與優(yōu)勢,構建了高效的TFs檢測平臺。第三章變構DNA-銀納米簇探針用于轉錄因子的檢測本章中,我們基于DNA-AgNCs構建變構的TFs探針,將其命名為變構DNA-銀納米簇開關探針(Allosteric DNA-silver nanocluster switches,AgSwitches)。DNA-AgNCs與GRS分別被設置于AgSwitches 5’末端與3’末端,當其與TFs結合后,在TFs誘導的變構作用以及不同構象之間的平衡移動原理作用下,AgSwitches從弱熒光的雙莖-環(huán)構象變構為強熒光的單莖-環(huán)構象,從而實現(xiàn)對TFs的熒光檢測。研究發(fā)現(xiàn),可以利用在線服務器NUPACK對AgSwitches的序列進行設計優(yōu)化,并提出了基于模擬吉布斯自由能優(yōu)化序列設計的初步原則。本實驗所獲得的AgSwitches能夠對TFs實現(xiàn)高靈敏、高特異性地檢測,并能夠用于實際樣品分析。該方法也能夠用于對TFs靶向抑制劑進行篩選,在醫(yī)藥研究領域具有發(fā)展?jié)摿�。本章研究設計了基于DNA-AgNCs的變構DNA納米機器,研究了其熱力學性質與分析性能之間的關系,并最終將其成功應用于TFs相關的生物醫(yī)學研究。
【圖文】：

南京醫(yī)科大學博MBs 的制備Bs 根據(jù)文獻提供的方法合成[36]。首先進行變溫處理：將 1OD 75 μL 緩沖液中（10 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 100 mM CH3COOCOO)2, pH 7.5），加熱至 95℃，維持 10 min 后緩慢降溫至 25為 1h。然后進行原位還原：加入 12μL，10mM 新制 AgNO3避光 4 °C 反應 30 min。接著，迅速加入 12 μL，10 mM 新制振搖混合 1 min，然后避光 4 °C 反應過夜。圖 1 為 AgMBs 制

然后避光 4 °C 反應過夜。圖 1 為 AgMBs 制備過程的示意圖。圖 1AgMBs 制備過程的示意圖2.4 樣品處理及熒光檢測將 NF-κBp50 的母液（0.5mg/mL）用含有 10%甘油的磷酸鹽緩沖液（10mM，pH 7.4）稀釋分裝。每 100 nM 的 dsNF-κBprobe 與不同濃度的 NF-κBp50 溶液，以及 10 μL 的結合緩沖液（10 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 100 mM CH3COONa, 10mM Mg(CH3COOH)2, 10% glycerol, 0.05 mg/mL poly(dI-dC), pH 7.4）混合。隨后，加入 2μL（10U/μL）的 ExoIII，以及 3μL 的 10×反應緩沖液，用來對 dsNF-κBprobe 進行酶切。隨后，向體系中加入 AgMBs（1 μM，10μL）
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R318

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本文編號：2707697