【摘要】：轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors,TFs)是細(xì)胞中的一類調(diào)控蛋白,是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最終效應(yīng)器,它們通過與基因中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合,控制基因的表達(dá),從而調(diào)控細(xì)胞的生長與分化。目前,已知的TFs已經(jīng)有大約1500種,研究表明TFs異常表達(dá)與人類疾病有著密切的關(guān)系。例如,核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)被證實(shí)在大量病毒感染、腫瘤病例中發(fā)生上調(diào);調(diào)節(jié)抑癌基因的p53蛋白在超過50%的腫瘤中失活;調(diào)控雌激素基因表達(dá)的雌激素受體(Estrogen receptor,ER)在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、精神疾病中均有異常表達(dá)。因此,TFs不僅是潛在的診斷標(biāo)志物,也是治療的靶點(diǎn)和藥物研究靶標(biāo)。正是由于TFs的重要地位,使得對TFs的高效檢測具有重要的意義,但是目前能夠同時滿足高效、高靈敏、低成本的檢測方法仍然缺乏。本文針對TFs的檢測,以DNA-銀納米簇(DNA-silver nanoclusters,DNA-AgNCs)為納米分析元件,從酶輔助信號放大、納米復(fù)合體系、變構(gòu)探針三個角度,研究了TFs傳感分析體系,并將這些體系應(yīng)用于TFs的生物樣品檢測,以及TFs抑制劑的篩選。各章內(nèi)容概括如下:第一章基于DNA-銀納米簇與核酸外切酶III輔助信號放大的轉(zhuǎn)錄因子檢測方法本章中,我們設(shè)計(jì)合成了DNA-AgNCs分子信標(biāo)(DNA-AgNCs molecular beacons,AgMBs),并基于AgMBs與核酸外切酶III(Exonuclease III,Exo III)輔助的信號放大技術(shù),開發(fā)了免標(biāo)記(Label-free)的TFs熒光傳感系統(tǒng)。通過Exo III的酶切作用,我們將TFs與對應(yīng)雙鏈結(jié)合序列的結(jié)合過程轉(zhuǎn)化為一段單鏈DNA(reporter)的釋放,然后AgMBs與Exo III共同作用實(shí)現(xiàn)對reporter的信號放大地檢測。AgMBs中用以調(diào)控?zé)晒庑盘栐鰪?qiáng)的富含鳥嘌呤的增強(qiáng)序列(GRS)是一段未經(jīng)修飾的DNA,為Exo III輔助的信號放大提供了原理基礎(chǔ),這也是AgMBs首次被用于信號放大系統(tǒng)。該傳感系統(tǒng)能夠?qū)?xì)胞核蛋白提取物中NF-κB p50進(jìn)行定量檢測,檢測限為10 pM(S/N=3),并能用于該TFs靶向抑制劑的評價與篩選。進(jìn)一步的,通過改變dsDNA的結(jié)合序列,該系統(tǒng)能夠用于分析多種TFs,具有較好的普適性。第二章基于DNA-銀納米簇/聚吡咯納米粒復(fù)合納米材料的多通路轉(zhuǎn)錄因子熒光檢測方法本章研究中,發(fā)卡狀的DNA-AgNCs與聚吡咯納米粒(Polypyrrole nanoparticles,PPyNPs)通過非共價作用相互吸附構(gòu)建復(fù)合納米材料DNAAgNCs/PPyNPs,并被用于TFs的檢測。DNA-AgNCs通過單鏈的環(huán)部分吸附在PPyNPs的表面,導(dǎo)致DNA-AgNCs與PPyNPs相互接近而產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致熒光猝滅。加入目標(biāo)TFs后,TFs與發(fā)卡狀DNA-AgNCs的雙鏈的莖部位結(jié)合,引發(fā)空間位阻效應(yīng)驅(qū)使DNA-AgNCs從PPyNPs的表面解吸附,導(dǎo)致熒光恢復(fù)�；赑PyNPs的低非特異性蛋白吸附性質(zhì),本方法與已有的基于空間位阻效應(yīng)的TFs檢測平臺相比靈敏度獲得了顯著提升,對NF-κB p50的檢測限為70 pM(S/N=3),對p53的檢測限為110 pM(S/N=3)。進(jìn)一步的,利用DNA-AgNCs熒光可調(diào)控的性質(zhì),設(shè)計(jì)了兩種具有不同熒光性質(zhì)并能夠分別識別不同TFs的DNAAgNCs,實(shí)現(xiàn)了對NF-κB p50于p53的熒光多通路檢測。本章的研究通過結(jié)合DNA-AgNCs與PPyNPs的特點(diǎn)與優(yōu)勢,構(gòu)建了高效的TFs檢測平臺。第三章變構(gòu)DNA-銀納米簇探針用于轉(zhuǎn)錄因子的檢測本章中,我們基于DNA-AgNCs構(gòu)建變構(gòu)的TFs探針,將其命名為變構(gòu)DNA-銀納米簇開關(guān)探針(Allosteric DNA-silver nanocluster switches,AgSwitches)。DNA-AgNCs與GRS分別被設(shè)置于AgSwitches 5’末端與3’末端,當(dāng)其與TFs結(jié)合后,在TFs誘導(dǎo)的變構(gòu)作用以及不同構(gòu)象之間的平衡移動原理作用下,AgSwitches從弱熒光的雙莖-環(huán)構(gòu)象變構(gòu)為強(qiáng)熒光的單莖-環(huán)構(gòu)象,從而實(shí)現(xiàn)對TFs的熒光檢測。研究發(fā)現(xiàn),可以利用在線服務(wù)器NUPACK對AgSwitches的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化,并提出了基于模擬吉布斯自由能優(yōu)化序列設(shè)計(jì)的初步原則。本實(shí)驗(yàn)所獲得的AgSwitches能夠?qū)Fs實(shí)現(xiàn)高靈敏、高特異性地檢測,并能夠用于實(shí)際樣品分析。該方法也能夠用于對TFs靶向抑制劑進(jìn)行篩選,在醫(yī)藥研究領(lǐng)域具有發(fā)展?jié)摿�。本章研究設(shè)計(jì)了基于DNA-AgNCs的變構(gòu)DNA納米機(jī)器,研究了其熱力學(xué)性質(zhì)與分析性能之間的關(guān)系,并最終將其成功應(yīng)用于TFs相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)研究。
【圖文】：

南京醫(yī)科大學(xué)博MBs 的制備Bs 根據(jù)文獻(xiàn)提供的方法合成[36]。首先進(jìn)行變溫處理：將 1OD 75 μL 緩沖液中（10 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 100 mM CH3COOCOO)2, pH 7.5），加熱至 95℃，維持 10 min 后緩慢降溫至 25為 1h。然后進(jìn)行原位還原：加入 12μL，10mM 新制 AgNO3避光 4 °C 反應(yīng) 30 min。接著，迅速加入 12 μL，10 mM 新制振搖混合 1 min，然后避光 4 °C 反應(yīng)過夜。圖 1 為 AgMBs 制

然后避光 4 °C 反應(yīng)過夜。圖 1 為 AgMBs 制備過程的示意圖。圖 1AgMBs 制備過程的示意圖2.4 樣品處理及熒光檢測將 NF-κBp50 的母液（0.5mg/mL）用含有 10%甘油的磷酸鹽緩沖液（10mM，pH 7.4）稀釋分裝。每 100 nM 的 dsNF-κBprobe 與不同濃度的 NF-κBp50 溶液，以及 10 μL 的結(jié)合緩沖液（10 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 100 mM CH3COONa, 10mM Mg(CH3COOH)2, 10% glycerol, 0.05 mg/mL poly(dI-dC), pH 7.4）混合。隨后，加入 2μL（10U/μL）的 ExoIII，以及 3μL 的 10×反應(yīng)緩沖液，用來對 dsNF-κBprobe 進(jìn)行酶切。隨后，向體系中加入 AgMBs（1 μM，10μL）
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R318

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本文編號：2707697