發(fā)布時間：2020-06-10 11:33

【摘要】：目的:基于鏈置換驅(qū)動DNA自組裝與催化核酸(G-四鏈體辣根過氧化物模擬酶)建立一種簡單、快速、靈敏且特異的microRNA-122-5p(miR-122-5p)生物傳感新體系,并對該檢測體系進(jìn)行評價,為miR-122-5p的檢測提供一個全新的策略。方法:1、檢測體系的建立:(1)根據(jù)miR-122-5p序列設(shè)計三個發(fā)卡探針Hairpin1(HP1)、Hairpin2(HP2)和Hairpin3(HP3)。利用miR-122-5p引發(fā)鏈置換反應(yīng),驅(qū)動三個探針自組裝形成兼容富G序列的DNA三叉結(jié)構(gòu)。瓊脂糖凝膠電泳和原子力顯微鏡分別從分子量及形態(tài)結(jié)構(gòu)上驗證DNA三叉結(jié)構(gòu)是否構(gòu)建成功。(2)富G序列在螯合了氯化血紅素(Hemin)之后形成G-四鏈體。利用G-四鏈體具有辣根過氧化物模擬酶活性和可作為淬滅基團(tuán)的特性分別構(gòu)建化學(xué)發(fā)光傳感平臺和熒光傳感平臺。通過對比實驗組(有miR-122-5p)與對照組(無miR-122-5p)時化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度和熒光信號強(qiáng)度,初步驗證這兩個平臺的可行性。采用正交實驗法,對化學(xué)發(fā)光和熒光傳感平臺的關(guān)鍵實驗條件進(jìn)行優(yōu)化(反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、氯化血紅素(Hemin)濃度、HP1/HC1(-CY3)、HP2/HC2(-CY3)和HP3/HC3(-CY3)的濃度等)。2、檢測體系的評價:對比化學(xué)發(fā)光傳感平臺和熒光傳感平臺的靈敏度,選擇靈敏度較高的傳感平臺,并繼續(xù)對其重復(fù)性、特異度、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性等方面進(jìn)行評價。結(jié)果:1、檢測體系建立:(1)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示:miR-122-5p+HP1+HP2+HP3的泳道有150bp大小的電泳條帶出現(xiàn),而HP1+HP2+HP3的泳道只有50bp大小的電泳條帶出現(xiàn)。原子力顯微鏡可以直觀的看到約20 nm大小的DNA三叉結(jié)構(gòu)形成。(2)化學(xué)發(fā)光傳感平臺可行性分析顯示,實驗組的發(fā)光強(qiáng)度為12369.17±1120.37 a.μ.,對照組的發(fā)光強(qiáng)度為3098.01±121.35 a.μ.,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。正交實驗結(jié)果顯示,最佳反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、Hemin、HP1、HP2和HP3的濃度分別為90min、42℃、100nM、150nM、200nM和100nM。熒光傳感平臺可行性分析顯示,實驗組的熒光強(qiáng)度為85.19±5.36 a.μ.,對照組的熒光強(qiáng)度為213.7±14.99 a.μ.,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。正交實驗結(jié)果顯示,最佳反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、Hemin、HC1(-CY3)、HC2(-CY3)和HC3(-CY3)的濃度分別為60min、42℃、100nM、150nM、200nM和100nM。2、檢測體系評價:靈敏度分析顯示,化學(xué)發(fā)光傳感平臺的最低檢測限為1.02 pM,熒光傳感平臺的最低檢測限為5.70 fM。重復(fù)性實驗顯示:不同濃度miR-122-5p的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均為低于7%。特異性分析顯示:單堿基錯配序列(single-base mismatched sequence,SM)、雙堿基錯配序列(double-base mismatched sequence,DM)、四堿基錯配序列(four-base mismatched sequence,FM)和miR-21引發(fā)的熒光強(qiáng)度都高于miR-122-5p引發(fā)的熒光強(qiáng)度,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。基質(zhì)效應(yīng)分析顯示:不同濃度miR-122-5p的RSD均低于6.5%。穩(wěn)定性分析顯示:1天、2天、3天、4天、5天分別測得的熒光強(qiáng)度值之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:基于DNA鏈置換反應(yīng)成功構(gòu)建了DNA三叉結(jié)構(gòu),并結(jié)合催化核酸G-四鏈體的信號放大功能實現(xiàn)了miR-122-5p的靈敏檢測。熒光傳感平臺的靈敏度要高于化學(xué)發(fā)光傳感平臺,最低檢測限可達(dá)5.70fM,且重復(fù)性好,可以識別單堿基錯配,穩(wěn)定性好,這為miR-122-5p的檢測提供了一個全新的傳感檢測策略。
【圖文】：

基 于miR-122-5p 的序列采用 Nupack 軟件設(shè)計三個發(fā)卡探針 HP1、HP2 和 HP3。如圖1-1 所示，HP1 的（a）區(qū)為富含鳥嘌呤（G）序列，（b）區(qū)是 miR-122-5p 的特異性識別區(qū)域。HP2 的（c）區(qū)為富含鳥嘌呤（G）序列，，（d）區(qū)可以與 HP1 的3’端頸部序列結(jié)合。HP3 的 e 區(qū)可以與 HP2 的 3’端頸部序列結(jié)合。粉紅色點表示在在熒光傳感體系中，我們在探針的 5’端標(biāo)記了 CY3 熒光分子。圖 1-1 發(fā)卡探針 HP1、HP2 和 HP3Fig. 1-1 Hairpin probe HP1、HP2 and HP3

圖 1-2 基于鏈置換的 miR-122-5p 化學(xué)發(fā)光傳感檢測原理圖Fig. 1-2 Schematic diagram of miR-122-5p chemiluminescence sensing detection based onstrand displacement
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TP212.3;R318

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本文編號：2706235