【摘要】：無(wú)精子癥在一般男性人群的發(fā)生率約為1%,而在存在不育問(wèn)題的男性中約為10%。無(wú)精子癥可分為梗阻性無(wú)精子癥(OA)和非梗阻性無(wú)精子癥(NOA)。睪丸活檢顯示NOA可表現(xiàn)為三種病理類型：生精功能低下、成熟阻滯和唯支持細(xì)胞綜合征。在以往,NOA患者被認(rèn)為是無(wú)法治愈的,只能通過(guò)領(lǐng)養(yǎng)或供精解決后代問(wèn)題。在1993年Schoysman R等人從OA患者的睪丸中提取睪丸精子用于體外受精(IVF)和卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)獲得成功。1995年DevroeyP等人從NOA癥患者的睪丸中提取精子并通過(guò)ICSI使卵子成功受精。從此,對(duì)NOA患者的治療而言,關(guān)鍵是如何高效的通過(guò)外科取精方法獲得足夠多的、高質(zhì)量的活動(dòng)精子。為達(dá)此目的,先后出現(xiàn)了幾種從NOA癥患者的睪丸中提取精子的方法。這些方法包括如下：(一)睪丸精子抽吸術(shù)(Testicular sperm aspiration,TESA);(二)針吸活檢取精(Needle aspiration biopsy, NAB);(三)睪丸活檢穿刺針穿刺取精(Cutting needle biopsy, CNB);(四)睪丸切開(kāi)活檢取精(Testicular sperm extraction,TESE);(五)單一曲細(xì)精管活檢術(shù)(Single seminiferous tubule biopsy,SSTB);(六)顯微切開(kāi)睪丸切開(kāi)取精(Microdissection TESE);(七)B超引導(dǎo)下睪丸取精術(shù)(Ultrasound-guided testicular sperm extraction)。 如何簡(jiǎn)單、高效的通過(guò)外科方法,從NOA患者的睪丸中獲得精子?對(duì)NOA患者的臨床治療有重大的現(xiàn)實(shí)意義。 由于每次從NOA患者的睪丸中獲得的精子很少,對(duì)這些睪丸精子的冷凍保存,因其數(shù)量極少,且精子細(xì)胞膜尚未完全成熟,精子核DNA的穩(wěn)定性也較差。采用常規(guī)精液標(biāo)本那樣的冷凍保存辦法已被證明效果很差。近年來(lái)隨著人們對(duì)玻璃化冷凍研究的不斷深入,研究者逐漸認(rèn)識(shí)到,人類的精子可以在不使用冷凍保護(hù)劑的情況下,通過(guò)一種稱為玻璃化冷凍方法成功的進(jìn)行冷凍和復(fù)蘇。這種冷凍方法要求在冷凍和解凍時(shí),要以很高的降溫速度進(jìn)行[達(dá)到(7.2×105)℃/min],以實(shí)現(xiàn)精子的玻璃化冷凍,在這一過(guò)程中,極高的凍融速率使得精子內(nèi)外液之間幾乎同步地由液態(tài)轉(zhuǎn)為玻璃態(tài)(冷凍時(shí)),或由玻璃態(tài)轉(zhuǎn)為液態(tài)(解凍時(shí))并無(wú)細(xì)胞內(nèi)外液間的交換,故精子內(nèi)外不會(huì)有冰晶的形成,從而避免了精子內(nèi)產(chǎn)生冰晶對(duì)精子的機(jī)械性損傷,也消除了精子外冰晶形成引起的理化損傷�，F(xiàn)有的研究資料顯示,玻璃化冷凍保存精子,方法簡(jiǎn)單、快速,而且不需專門的冷凍設(shè)備。研究和探索微量精子的玻璃化冷凍,對(duì)NOA患者的臨床治療亦有重大的現(xiàn)實(shí)意義。 第一部分兩種外科取精方法在造模少精子癥或無(wú)精子癥大鼠獲精率的比較 目的：比較單個(gè)曲細(xì)精管取精術(shù)和常規(guī)睪丸切開(kāi)取精術(shù)在造模少精子癥或無(wú)精子癥大鼠中的獲精率,以期為臨床找到一種簡(jiǎn)單、微創(chuàng)和高效的針對(duì)非梗阻性無(wú)精子癥的外科取精方法。 方法：45只實(shí)驗(yàn)雄性大鼠分A、B、C、D、E、F、G、H和Ⅰ共九組。A組、B組和C組,每組9只大鼠；D組、E組、F組、G組、H組和Ⅰ組,每組3只大鼠。每只實(shí)驗(yàn)大鼠一次性腹腔注射白消安和環(huán)磷酰胺,劑量分別為5mg/kg和40mg/kg(A組),5mg/kg和80mg/kg(B組),5mg/kg和120mg/kg(C組),10mg/kg和40mg/kg(D組),10mg/kg和80mg/kg(E組),10mg/kg和120mmg/kg(F組),15mg/kg和40mg/kg(G組),15mg/kg和80mg/kg(H組),15mg/kg和120mg/kg(Ⅰ組)。注射后將九組大鼠混合后常規(guī)飼養(yǎng)。于注射后第15天、第20天、第25天和第30天,每次隨機(jī)取7只大鼠用于實(shí)驗(yàn)；第35天將剩余的大鼠全部用于實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共有10只大鼠死亡,共有35只大鼠最終接受了睪丸外科取精子術(shù)。對(duì)每只接受睪丸外科取術(shù)的大鼠,實(shí)驗(yàn)方法為同一大鼠的一側(cè)睪丸采用單個(gè)曲細(xì)精管取精,另一側(cè)睪丸采用常規(guī)睪丸切開(kāi)取精。兩種取精方法所獲得的睪丸組織處理后立即制成濕片,在倒置顯微鏡下放大200倍尋找精子。 結(jié)果：45只實(shí)驗(yàn)大鼠,造模后10只死亡,最終進(jìn)入實(shí)驗(yàn)性外科取精的大鼠35只。采用單個(gè)曲細(xì)精管活檢取精方法共活檢35只造模大鼠的一側(cè)睪丸,獲精率為65.7%(23/35)；采用常規(guī)睪丸切開(kāi)活檢取精方法活檢其另一側(cè)睪丸,獲精率為40%(14/35)。 第二部分采用不同的微載體和不同的冷凍方法對(duì)小鼠睪丸單個(gè)精子冷凍復(fù)蘇效果的比較 目的：比較采用不同的微載體和不同的冷凍方法對(duì)小鼠睪丸單個(gè)精子的冷凍復(fù)蘇效果,以期為臨床找到一種簡(jiǎn)單、高效的,針對(duì)非梗阻性無(wú)精子癥患者睪丸微量精子的冷凍保存方法。 方法：10周齡雄性昆明小鼠,通過(guò)睪丸切開(kāi)活檢取精法,獲得睪丸組織,物理研碎后,經(jīng)體外培養(yǎng),單層密度梯度離心后獲得小鼠的睪丸精子。A組采用透明帶不加冷凍保護(hù)劑的玻璃化冷凍；B組采用ICSI針不加冷凍保護(hù)劑的玻璃化冷凍；C組采用透明帶常規(guī)冷凍；D組采用ICSI針常規(guī)冷凍,每組各冷凍50個(gè)小鼠睪丸活動(dòng)精子。比較精子復(fù)蘇后的回收率和活動(dòng)率兩項(xiàng)指標(biāo)。 結(jié)果：A組解凍復(fù)蘇后精子回收率為96.0%(48/50),精子活動(dòng)率為89.6%(43/48)；B組解凍復(fù)蘇后精子回收率為84.0%(42/50),精子活動(dòng)率為95.2%(40/42)C組解凍復(fù)蘇后精子回收率為98.0%(49/50),精子活動(dòng)率為61.2%(30/49)D組解凍復(fù)蘇后精子回收率為90.0%(45/50),精子活動(dòng)率為68.9%(31/45) 第三部分小鼠睪丸單個(gè)精子的玻璃化冷凍對(duì)卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射治療結(jié)果的影響 目的：了解不加冷凍保護(hù)劑的玻璃化法冷凍小鼠睪丸精子對(duì)卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射治療結(jié)果的影響。 方法：通過(guò)睪丸切開(kāi)活檢取精方法獲得小鼠睪丸精子。玻璃化冷凍組為采用不加冷凍保護(hù)劑的玻璃化法冷凍復(fù)蘇后的小鼠睪丸精子,新鮮組為來(lái)自小鼠睪丸的新鮮精子,兩組精子均采用卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射方法使卵子受精,比較兩組的2-細(xì)胞胚胎的受精率。 結(jié)果：玻璃化冷凍組共注射48個(gè)成熟卵子,2-細(xì)胞胚胎37個(gè),2-細(xì)胞胚率為77.1%；新鮮組共注射55個(gè)成熟卵子,2-細(xì)胞胚胎44個(gè),2-細(xì)胞胚率為80.0%。 結(jié)論： 1.和常規(guī)睪丸切開(kāi)取精子方法相比,單個(gè)曲細(xì)精管活檢取精子方法獲精率更高,而且操作簡(jiǎn)單對(duì)睪丸創(chuàng)傷小,值得在NOA患者的睪丸取精中推廣。 2.在對(duì)來(lái)自睪丸的單個(gè)精子進(jìn)行冷凍保存時(shí),采用空透明帶作為微載體在解凍復(fù)蘇后精子回收率方面優(yōu)于ICSI針,但采用ICSI針在解凍復(fù)蘇后可獲得更高的精子活動(dòng)率；采用不加冷凍保護(hù)劑的玻璃化冷凍優(yōu)于常規(guī)冷凍。 3.采用不加冷凍保護(hù)劑的玻璃化法冷凍保存微量睪丸精子是一種安全、經(jīng)濟(jì)、有效的冷凍保存方法,冷凍復(fù)蘇后采用ICSI技術(shù)可取得與新鮮精子相似的受精率。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R698.2;R318.52

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本文編號(hào)：2694272