【摘要】：研究背景:造血干細胞(Hematopoietic stem cell,HSC)是一種具有自我更新和多向分化潛能的干細胞,目前HSC移植用來治療各種疾病包括白血病、淋巴瘤、免疫系統(tǒng)疾病、多發(fā)性骨髓瘤以及骨髓衰竭綜合征。目前全球同種異體和自體HSC移植得到廣泛臨床應用,但是仍然面臨著諸多問題,如供著來源的HSC數量,獲得人的白細胞抗原匹配的供者以及移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)。多能干細胞(Pluripotent Stem Cell,PSC)包括胚胎干細胞(Embryonic Stem Cell,ESC)和誘導性多能干細胞(Induced Pluripotent Stem Cell,iPSC),具有體外自我更新和多向分化潛能,因此可以源源不斷的提供移植所需要的HSC,另外從病人身上通過體細胞重編程技術獲得的PSC,體外誘導分化產生HSC,可作為疾病模型探究疾病的病因,同時提供一個以細胞為基礎藥物篩選平臺。盡管在過去數十年,研究者們不斷在探究PSC誘導分化產生可移植的HSC,但并沒有建立一種高效獲得PSC來源的可供移植的HSC。目前PSC向HSC分化方法主要有(1)利用小鼠或人的基質細胞來誘導PSC造血分化;(2)利用擬胚體(Embryonic bodies,EBs)方法來誘導PSC造血分化;(3)兩種方法相結合;(4)畸胎瘤方法。同時采用細胞因子和轉錄因子結合上述方法,但是PSC向HSC分化依然存在關鍵科學問題需待解決:(1)誘導分化效率不高;(2)誘導分化獲得的HSC體內很難實現長期造血植入潛能。前期的PSC造血分化研究集中于二維環(huán)境中進行,其實三維環(huán)境較二維環(huán)境能更接近的模擬自然狀態(tài)下三維組織結構,在體內胚胎造血發(fā)育過程中,細胞與細胞之間不僅相互接觸,還需要與周圍的細胞外基質環(huán)境所包含的各種黏附分子、膠原蛋白等組分相互接觸共同來完成胚胎造血發(fā)育的過程。細胞外基質環(huán)境對細胞的增殖、分化、維持以及組織形態(tài)構成起著重要作用。現在研究者們日益致力于開發(fā)新型具有型模擬體內三維組織結構和細胞外基質生物學功能的生物材料來調控干細胞的生物學功能。體內胚胎造血發(fā)育過程中,造血微環(huán)境如主動脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonads-mesonephros,AGM)、胎肝和骨髓中的基質細胞有利于促進體外PSC向HSC分化并維持和擴增PSC來源的HSC。研究報道AGM區(qū)來源的基質細胞AGM-S3促進人和小鼠的HSC擴增[34]。同時AGM-S3聯(lián)合各種細胞因子促進人PSC向造血干細胞及下游譜系成體有核紅細胞分化[35,36]。小鼠胎肝部位來源的基質細胞AFT024能體外高效維持小鼠造血干細胞的長期造血潛能[37]。人的胚胎干細胞與S17、骨髓來源的基質細胞OP9以及胎肝來源的基質細胞共培養(yǎng)自然誘導其向造血細胞分化,但是體外誘導分化效率低,獲得的HSC體內沒有或非常低的造血植入潛能[38]。本研究擬利用三維生物材料結合外源性促進PSC向HSC分化和擴增HSC的細胞生長因子,建立一種三維誘導小鼠PSC向HSC分化的體系,并結合HSC造血微環(huán)境中的基質細胞來優(yōu)化建立的三維誘導分化體系,目的為了獲得小鼠PSC來源的長期造血的HSC,同時我們比較3D培養(yǎng)系統(tǒng)和2D培養(yǎng)環(huán)境下對小鼠造血干祖細胞的擴增效果,為體外探究PSC向HSC分化的分子調控機制提供研究平臺,為促進PSC來源的HSC向臨床應用轉化奠定理論基礎。1第一章利用自組裝多肽生物材料建立小鼠多能干細胞向造血細胞分化的誘導體系目的:體外誘導PSC產生HSC能作為替代骨髓移植的有效手段,并且不會引起GVHD。目前,多種方法被用于評估PSC向HSC的分化,但是誘導分化效率低以及獲得HSC功能不完整限制了造血分化的進一步研究。我們研究目的為了建立一種更好模擬體內胚胎發(fā)育的3D造血誘導分化環(huán)境,促進PSC產生功能性的HSC,而這種3D誘導的條件的復雜性很難通過2D培養(yǎng)系統(tǒng)來實現。方法:首先用掃描電鏡技術觀察3D自組裝多肽水凝膠的結構特征;其次探究3D自組裝多肽水凝膠聯(lián)合造血相關細胞因子誘導小鼠PSC向造血細胞分化,流式檢測ckit、CD41、CD45表面分子蛋白的表達水平,熒光定量PCR檢測多能性基因Oct3/4、內皮細胞相關基因CDH5、造血相關基因Gata1和HOXA9,造血表面分子CD41和CD45的表達;免疫熒光檢測CD41和CD45表面分子蛋白水平表達;克隆形成實驗(Colony Formation Unit,CFU)驗證3D誘導系統(tǒng)分化獲得的造血細胞體外向造血各譜系分化的潛能;6-8周NOD-SCID小鼠用來評估3D誘導系統(tǒng)來源的造血細胞的體內植入潛能。結果:利用3D自組裝多肽水凝膠聯(lián)合細胞因子能有效誘導小鼠PSC向造血細胞分化,流式檢測結果顯示ckit、CD41、CD45表面分子明顯表達;熒光定量PCR檢測表明多能性基因Oct3/4表達下調、內皮細胞相關基因CDH5、造血相關基因Gata1和HOXA9,造血表面分子CD41和CD45的基因表達上調;免疫熒光檢測CD41、CD45表面分子得到表達;CFU克隆形成實驗表明,3D造血誘導系統(tǒng)來源的造血細胞具有向各造血譜系克隆分化潛能;另外體內動物移植實驗顯示,移植三周后,外周血檢測,CD45.2+細胞在NOD-SCID(CD45.1)小鼠體內植入率有3%,3D造血誘導系統(tǒng)分化獲得具有短期造血植入潛能的多潛能造血祖細胞。結論:利用3D自組裝多肽水凝膠聯(lián)合細胞因子能有效誘導小鼠PSC向造血細胞分化,獲得體外向各譜系造血分化潛能的造血細胞,體內具有短期造血植入潛能的造血祖細胞。2第二章利用OP9基質細胞提高自組裝多肽生物材料介導的3D誘導分化體系的效率目的:OP9或OP9-DL1基質細胞體外有利于促進PSC向HSC分化,同時可促進體外胚胎發(fā)育過程中造血前體細胞和生血內皮細胞向HSC成熟分化,在第一章建立3D誘導小鼠PSC向HSC分化中,每個PSC向HSC分化不是同步的,3D系統(tǒng)中存在多種造血前體和發(fā)育早期造血細胞,我們接下來研究目的是利用造血微環(huán)境基質細胞OP9來進一步優(yōu)化3D造血誘導分化系統(tǒng),目的為了增強PSC向造血干祖細胞分化效率,獲得更多功能性的HSC,為PSC向HSC分化的機制研究奠定工作基礎。方法:OP9基質細胞聯(lián)合細胞因子進一步誘導3D誘導系統(tǒng)分化來的造血樣克隆,流式檢測不同時間段中胚層表面分子、生血內皮細胞、造血干祖細胞的表面分子flk1、ckit、TIE2、CD144、CD41、CD45、Sca-1 以及目前最新文獻報道的 CD201表面分子的表達;CFU克隆形成實驗驗證OP9基質細胞優(yōu)化3D誘導系統(tǒng)分化獲得的造血細胞向造血各譜系分化的潛能;結果:OP9基質細胞能有效促進3D誘導系統(tǒng)分化來的造血樣克隆向造血前體及造血干祖細胞進一步成熟分化,流式檢測結果顯示ckit、TIE2、CD144、CD41、CD45、Sca-1、CD201表面分子明顯表達;中胚層表面分子標記flk1表達水平在共培養(yǎng)誘導分化第2天到第5天上調,第5天到第8天明顯下調;CFU克隆形成實驗表明,OP9基質細胞優(yōu)化3D造血誘導系統(tǒng)來源的造血細胞具有向各造血譜系克隆分化潛能;結論:利用OP9基質細胞能有效促進3D誘導系統(tǒng)分化來的造血樣克隆向造血前體及造血干祖細胞進一步成熟分化,產生一群類似于胚胎發(fā)育過程中AGM區(qū)的pre-HSC,并且獲得一群未見報道的CD201+LSK造血細胞。3第三章自組裝多肽生物材料介導的3D培養(yǎng)體系較2D培養(yǎng)體系利于小鼠造血干祖細胞的擴增目的:為了探究自組裝多肽生物材料介導的3D誘導系統(tǒng)確實有助于為體外探究PSC向HSC提供好的平臺,我們進一步比較所建立的3D誘導系統(tǒng)較2D誘導系統(tǒng)是否有效對小鼠骨髓來源的造血干祖細胞進行擴增,為探究3D系統(tǒng)之所以利于PSC向HSC誘導分化的機理研究奠定基礎。方法:分選小鼠骨髓來源的ckit+細胞,利用3D自組裝多肽生物材料水凝膠聯(lián)合造血相關細胞因子及小分子化合物對其擴增,并與2D同樣擴增條件下作以比較擴增效果,普通光鏡下觀察ckit+細胞生長情況,流式檢測兩種不同條件下Lineage-Sca-1+ckit+(LSK)細胞比例,以及向下游各造血譜系細胞分化的程度。CFU克隆形成實驗比較兩種不同擴增條件克隆形成能力差別。結果:3D自組裝多肽水凝膠聯(lián)合細胞因子及小分子化合物,較2D同樣條件下擴增ckit+細胞,能更好維持造血干祖細胞,3D環(huán)境中LSK(Lineage-Sca-1+ckit+)陽性細胞比例較2D條件下高,有明顯差異;CFU克隆形成實驗表明,3D與2D比較,同樣細胞數量條件下,3D的CFU克隆數比2D的CFU克隆數高,有明顯差異。結論:自組裝多肽生物材料介導的3D培養(yǎng)體系較2D培養(yǎng)體系更有利于維持小鼠骨髓來源的造血干祖細胞干性,并且利于HSC下游血液各譜系細胞的生長維持,與2D比較,3D系統(tǒng)能更好模擬體內,營造維持HSC干性微環(huán)境,為探究PSC向HSC分化提供理論依據。
【圖文】：

其集落形態(tài)呈現一定的不規(guī)則形態(tài)，不規(guī)則圓形、橢圓形或呈島嶼狀，。逡逑穩(wěn)定傳代的小鼠ＥＳＣ和ｉＰＳＣ細胞，增殖能力很強，一般按照１：４－１：６的比例傳代，逡逑２－３天便可再次傳代，見圖１．１逡逑圖１．１邋ＥＳＣ和ｉＰＳＣ細胞光學顯微鏡下形態(tài)。Ａ，邋Ｃ５７ＢＬ／６小鼠ＥＳＣ細胞形態(tài)，Ｓｃａｌｅ逡逑ｂａｒ邋＝１０0ｎｍ；邋Ｃ，ＩＣＲ小鼠胚胎成纖維細胞誘導來源的ｉＰＳＣ細胞形態(tài)，Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ逡逑＝１００＾ｉｍ0逡逑１．４．２邋３Ｄ自組裝多肽水凝膠掃描電鏡下結構逡逑我們使用的３Ｄ自組裝多肽水凝膠，，成分為自組裝短肽ＲＡＤＡ－１６，多肽序列逡逑是由精氨酸、天門冬氨酸和丙氨酸連接的多肽序列組成，其形成的納米纖維網絡逡逑結構，纖維直徑２０－５０邋ｎｍ，具有類似體內細胞外基質的結構，形成的納米自組裝逡逑多肽水凝膠形成的孔徑約為５？ｌＯｐｍ，交織形成立體網狀結構，見圖１．２，作為支逡逑架材料培養(yǎng)細胞可達到真正意義上的三維培養(yǎng)要求。逡逑１５逡逑

同時也促進造血樣細胞擴增。誘導分化第８天時候，每個克隆周邊都有許多圓圓逡逑的造血樣細胞出現，表明我們所采用的３Ｄ自組裝多肽生物材料系統(tǒng)能有效促進小逡逑鼠多能干細胞向造血分化，見圖１．３。逡逑Ａ邋ＥＢ邋Ｍｅｓｏｄｅｒｍ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋＞邋３Ｄ邋Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ邋ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋＞逡逑Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ邋ｒｅｌａｔｅｄ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ邋ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ逡逑Ｂ．ＭＰ４邐Ｂ．ＭＰ４／Ａｃｔｉｖｉｎ－ＡＡＥＧＦ邐Ａｃｔｉｖｉｎ－Ａ邋Ａ邋ＥＧＦ／Ｆｌｔ３－ＵＴＰ０／ＳＣＦ／逡逑ｄａｙＯ邐ｄａｙ２邐ｄａｙ４邐ｄａｙ６－８逡逑１６逡逑
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 XIE JingJing;ZHANG ChengCheng;;Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells[J];Science China(Life Sciences);2015年09期

2 Zhuan Li;Fan Zhou;Dongbo Chen;Wenyan He;Yanli Ni;Lingfei Luo;Bing Liu;;Generation of Hematopoietic Stem Cells from Purified Embryonic Endothelial Cells by a Simple and Efficient Strategy[J];Journal of Genetics and Genomics;2013年11期

3 ;Characterization of OP9 as authentic mesenchymal stem cell line[J];遺傳學報;2010年07期

本文編號：2665950