發(fā)布時(shí)間：2020-05-10 17:35

【摘要】：背景由于固有的結(jié)構(gòu)特征及生物特性使其難以自我修復(fù),軟骨再生和修復(fù)的困難受到了很多關(guān)注。組織或器官的缺損是某些難治性疾病的最終臨床表現(xiàn),如外傷或骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)導(dǎo)致的軟骨缺損,骨壞死骨不連導(dǎo)致的骨缺損。隨著干細(xì)胞技術(shù)的運(yùn)用,細(xì)胞治療已被用來修復(fù)缺損,多項(xiàng)研究顯示脂肪來源的干細(xì)胞具有最好的軟骨分化潛能。細(xì)胞片層是含有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的一層完整的片狀結(jié)構(gòu),含有離子通道、生長因子受體和連接蛋白等重要的細(xì)胞表面蛋白,具有傳統(tǒng)組織工程技術(shù)不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。通過特定的培養(yǎng)技術(shù)可在一定程度上完整獲取該片層而不明顯破壞上述結(jié)構(gòu)和成分。理想的關(guān)節(jié)軟骨再生不僅僅指外觀的一致性和完整性,還包括修復(fù)區(qū)域的結(jié)構(gòu)盡可能與原位結(jié)構(gòu)相似,并且新生軟骨隨著時(shí)間的推移進(jìn)行代謝。缺損邊緣組織產(chǎn)生的局部新生軟骨形態(tài)表明細(xì)胞從自體軟骨邊緣良好地遷移是非常重要的。因此,可以促進(jìn)細(xì)胞遷移,維持結(jié)構(gòu)并提供良好微環(huán)境的支架在修復(fù)過程中尤為重要。適當(dāng)?shù)拿摷?xì)胞步驟可以有效去除軟骨組織中的細(xì)胞成分,避免移植物-宿主免疫反應(yīng)造成的結(jié)構(gòu)破壞和ECM丟失,從而保持與天然結(jié)構(gòu)相近的機(jī)械和生物性能。微孔化的軟骨有助于脫細(xì)胞過程中軟骨深層細(xì)胞的去除,而脫細(xì)胞ECM有助于細(xì)胞遷移及ECM沉積。本研究探索了微孔化骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備及脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(ASCs)片層的獲取,并以此為基礎(chǔ),將微孔化骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合ASCs片層作為一種生物材料用于兔骨軟骨缺損模型并進(jìn)一步評(píng)估這種材料用于骨軟骨缺損的軟骨修復(fù)及整合效果。目的本課題旨在探索兔脂肪來源的ASC細(xì)胞片的構(gòu)建方法,解析不同時(shí)間點(diǎn)ASC細(xì)胞片的形態(tài)特點(diǎn)、組織學(xué)特征、潛在軟骨分化能力,微孔化骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備及其特性研究,微孔化骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合ASCs片層促進(jìn)兔軟骨缺損修復(fù)及界面整合的作用。方法在新西蘭白兔的髕骨溝中建立全層圓柱形缺損模型,設(shè)置骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)組、微孔化骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)組,微孔化骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合ASCs細(xì)胞片層組,分別將相應(yīng)的移植物移植于缺損區(qū)域。術(shù)后6周和12周,經(jīng)形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及分子生物學(xué)評(píng)估整合和修復(fù)效果。結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)中,微孔化骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合細(xì)胞片層移植培養(yǎng)4周后與周圍組織結(jié)合緊密,移植物邊緣未見明顯的孔隙。組織學(xué)鏡下觀察細(xì)胞片層填充于縫隙之中并維持著結(jié)構(gòu)連續(xù)性。微孔化骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合細(xì)胞片層組Collagen Ⅱ,Agg和Sox9表達(dá)高于對(duì)照組,Collagen X低于對(duì)照組,且有顯著性差異。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,微孔化脫細(xì)胞骨軟骨基質(zhì)復(fù)合細(xì)胞片層組6周時(shí)缺損邊界已不明顯,修復(fù)表面光整,12周時(shí)較難辨認(rèn)出邊界及修復(fù)區(qū)域,表面光整連續(xù)。組織學(xué)鏡下觀察到,6周時(shí)在微孔化骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合細(xì)胞片層組中,生成了更多的軟骨樣組織,軟骨下骨可見重塑。12周時(shí)在微孔化骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合細(xì)胞片層中,缺損的上層充滿軟骨樣組織,表面平滑,新生軟骨與其宿主軟骨及其軟骨下骨整合良好。軟骨下骨修復(fù)重建良好。6周和12周微孔化骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合細(xì)胞片層組CollagenⅡ,Agg和Sox9表達(dá)高于另外兩組,CollagenX低于另外兩組,且有顯著性差異。偏正光顯微鏡觀察顯示在微孔化骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合細(xì)胞片層組中,修復(fù)組織內(nèi)的膠原纖維類似于正常關(guān)節(jié)軟骨組織中的膠原纖維。修復(fù)組織內(nèi)的雙折射(膠原含量的指標(biāo))略弱于周圍軟骨。結(jié)論將微孔化骨軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)支架復(fù)合ASCs片層的新方法可以增強(qiáng)軟骨再生和修復(fù)并促進(jìn)新生軟骨與周圍軟骨整合。
【圖文】：

江大學(xué)碩士學(xué)位論文邐正文．結(jié)果逡逑．１邋ＡＳＣｓ形態(tài)及三系分化逡逑第三代的ＡＳＣｓ在分離、傳代和增殖后呈現(xiàn)梭形形態(tài)和均勻分布。成脂誘導(dǎo)見大而圓的脂滴，油紅染色成橘紅色；成骨誘導(dǎo)分化可見分布的鈣結(jié)節(jié)，染色呈紅色；成軟骨誘導(dǎo)分化可見軟骨微球切面甲苯胺藍(lán)染色呈藍(lán)色的多。三系分化實(shí)驗(yàn)表明ＡＳＣｓ具有分化成成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的潛

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文邐正文結(jié)果逡逑表明，短時(shí)間內(nèi)較高濃度的抗壞血酸具有更好的促增殖作用，但是隨著時(shí)間的增逡逑長，２０ｐｇ／ｍｌ和４０ｐｇ／ｍｌ的抗壞血酸濃度具有更好的促增殖作用，與其他組之間的差逡逑異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但２0ｎｇ／ｍｌ與４0ｉａｇ／ｍｌ的抗壞血酸濃度對(duì)ＡＳＣｓ增殖無顯著性差逡逑異，故選擇２0ｎｇ／ｍｌ抗壞血酸濃度。逡逑１ｄ邐３ｄ逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318.08

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4 吉U，

本文編號(hào)：2657649