【摘要】：解決器官相關(guān)致死性疾病最有效方法是器官移植,但是可被用于移植供體的相應(yīng)器官來源、數(shù)量十分有限,因此提出設(shè)想,用囊胚補償法在動物體內(nèi)制備出特定的人源化豬器官/組織,用來減緩出現(xiàn)的器官供應(yīng)短缺的阻礙。由于豬,特別是小型豬和人類在眾多生理生化、身體結(jié)構(gòu)等方面相似性十分高,因此利用經(jīng)基因編輯過的具有發(fā)育“空位”的小型豬與可在特定部位進(jìn)行補償?shù)哪遗哐a償法制備可培育出特定的人源化器官或組織的嵌合體豬,可被使用解決移植用供體器官數(shù)量嚴(yán)重不足的問題,同時減緩因為移植出現(xiàn)的免疫排斥反應(yīng)。1.缺乏延胡索酸乙酰乙酸水解酶(Fumarylacetoacetatehydrolase,FAH)會引起遺傳性酪氨酸血癥I型(Hereditary tyrosinemia typel,HTI),致使患者的肝臟細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,進(jìn)而呈現(xiàn)出肝損傷表現(xiàn)。本研究利用 α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGT41)敲除巴馬豬的組織樣本作為研究基礎(chǔ)材料,利用CRISPR/Cas9和體細(xì)胞核移植技術(shù)制備FAH基因敲除(FAH+/-、FAH-/-)豬,并分析其健康與繁育狀況。采集FAH+/-巴馬豬血液,檢測其血生化與血常規(guī)指標(biāo);當(dāng)F0代FAH+/-巴馬豬公豬性成熟后,與野生型(wild type,WT)母豬配種,以其產(chǎn)仔數(shù)評價繁育能力狀況。通過WestemBlot檢測FAH+/-巴馬豬FAH蛋白表達(dá)量有所下降。此FAH+/-巴馬豬的成功獲得為后續(xù)制備HTI疾病模型豬及人源化器官的研究提供了可靠的數(shù)據(jù)及材料。2.KITLG(KIT ligand)又稱干細(xì)胞因子(SCF),是一種結(jié)合CD117(C-kit)的細(xì)胞因子,是造血干/祖細(xì)胞生存、增生和分化的重要生長因子。由于KITLG基因的敲除會使機體造血系統(tǒng)發(fā)育出現(xiàn)障礙,使得該基因敲除豬無法在母體內(nèi)正常生長發(fā)育,因此48d時殺豬取胚胎,10只胚胎中只有一只保持較為完整的形態(tài),其余均退化剩余部分肉糜狀組織。提取胚胎基因組DNA鑒定突變類型均為KITLG-/-,KITLG-/-胚胎與相似發(fā)育階段野生型胚胎比較,體型明顯小于野生型且肝臟也小于野生型的且呈現(xiàn)出灰白色;HE染色后觀察KITLG-/-胚胎肝臟切片中缺少血管內(nèi)皮血細(xì)胞。由于KITLG基因的敲除會造成該基因克隆豬造血功能缺陷使其無法存活,因此獲得相關(guān)早期胚胎,為后續(xù)制備可生產(chǎn)人血液嵌合體豬奠定研究基礎(chǔ)。3.本研究通過囊胚補償法,利用可造成機體特定器官發(fā)育受阻的FAH和KITLG基因的敲除胚胎作為實驗組,通過顯微注射將人類胚胎干細(xì)胞注入來填補發(fā)育空缺,在理論上增加嵌合體的嵌合成功率與嵌合程度。KITLG-/-胚胎在注射H9-td Tomato細(xì)胞后并未像FAH-/-胚胎和孤雌胚胎一樣可正常發(fā)育到囊胚階段;在隨后觀察各組桑椹胚期及囊胚期注射H9-td Tomato細(xì)胞胚胎時,發(fā)現(xiàn)它們的桑椹胚數(shù)及囊胚數(shù)與對照組未進(jìn)行注射的相比,數(shù)目均有所下降。由于人、豬之間物種差異極大,通過熒光顯微鏡觀察,豬囊胚與H9-td Tomato細(xì)胞嵌合率極低�？傊�,本研究探索了利用囊胚補償法制備人-豬嵌合胚,為將來獲得人源化器官,推進(jìn)了異種嵌合體及異種移植的研究并提供了可供參考的有價值基礎(chǔ)理論研究數(shù)據(jù)。本研究將畜牧學(xué)與醫(yī)學(xué)相結(jié)合,是畜牧學(xué)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的研究。
【圖文】：

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本文編號：2657327