【摘要】：研究背景:骨缺損的修復是臨床上亟待解決的問題之一,現(xiàn)階段骨缺損的治療方法主要有:自體骨移植,異體骨移植以及人工合成替代物移植等。然而自體骨和異體骨移植因來源和排異反應等問題,應用受到了很大限制。因此人工合成骨替代物一直是組織工程和再生領(lǐng)域研究的熱點。骨在體內(nèi)是由成骨細胞與成骨細胞分泌的細胞外基質(zhì)(ECM)中的礦化膠原纖維后作為骨的基本結(jié)構(gòu),進一步螺旋排布形成復雜的骨。礦化膠原纖維和成骨細胞一直是骨再生領(lǐng)域中研究者們關(guān)注的熱點。然而細胞的體外培養(yǎng)大部分是在二維空間培養(yǎng),培養(yǎng)時細胞表面與二維培養(yǎng)皿接觸,導致細胞微環(huán)境發(fā)生變化,改變了細胞干性的表達。為保存完整的細胞微環(huán)境,對細胞進行三維培養(yǎng)是近來的研究方向之一。體外支架材料如β-TCP以及礦化膠原材料都無法真實模擬出骨細胞的自然分泌形成過程。因此我們試圖在體外模擬骨的形成過程,構(gòu)建出一個由細胞和自分泌的礦化細胞外基質(zhì)作為基本結(jié)構(gòu)的細胞微球,進一步探討所構(gòu)建出微球的性能變化。研究目的:合成具有三維空間結(jié)構(gòu)的細胞自分泌及組裝的細胞微球(Cell Spheroid,CS)。模擬體內(nèi)骨的礦化過程,在體外對具有三維結(jié)構(gòu)的細胞微球進行礦化誘導;得到類似于骨基本結(jié)構(gòu),由細胞自分泌的礦化基質(zhì)和細胞共同組成的復合物—礦化細胞外基質(zhì)細胞微球(Mineralized-ECM Cell Spheroid,MECS)。探討MECS的成骨能力,以及在骨缺損區(qū)域的修復效果。探討MECS作為骨再生移植物的優(yōu)勢與不足。方法:體外通過三維微孔培養(yǎng)板接種大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞后通過將Ca~(2+)、PO_4~(3-)離子的加入,獲得細胞微球(Cell Spheroid,CS)、礦化細胞外基質(zhì)的細胞微球(Mineralized-ECM Cell Spheroid,MECS)。體外通過掃描電鏡(SEM)、原子力顯微鏡(AFM)對微球的形貌、成分、力學性能進行分析。Live/dead assay(活/死細胞檢測)進行微球中細胞狀態(tài)進行檢測。激光共聚焦顯微鏡來觀察細胞微絲骨架(F-actin)、細胞核(DAPI)以及細胞分布。體外通過Real-time PCR檢測CS與MECS細胞中成骨相關(guān)基因ALP、BMP-2的表達差異;體內(nèi)移植后應用Micro-CT,組織學染色來觀察CS和MECS是否在骨再生領(lǐng)域有良好的應用,是否擁有組織工程再生材料的三大特性:骨引導、骨誘導和成骨性。結(jié)果:在研究中,我們成功合成CS和MECS兩種細胞微球,經(jīng)檢測,MECS細胞外基質(zhì)中有納米羥基磷灰石的分布,其力學性能遠優(yōu)于CS,細胞含量以及直徑尺寸上也優(yōu)于CS。通過體外PCR檢測基因表達情況,我們發(fā)現(xiàn)MECS的成骨相關(guān)基因ALP、BMP-2的表達量較CS增高,在裸鼠實驗中,也與體外PCR檢測相一致,MECS的體內(nèi)有骨樣結(jié)構(gòu)生成。在骨缺損區(qū)域修復的應用中,Micro-CT顯示:骨缺損區(qū)域已由MECS的新生骨填滿,從組織學染色分析,MECS新生骨區(qū)域包含成熟骨組織以及豐富的血管結(jié)構(gòu)。結(jié)論:1.成功在體外通過自組裝的形式合成具有三維礦化細胞外基質(zhì)的細胞微球。2.細胞外基質(zhì)中的納米羥基磷灰石提高了細胞微球的強度和支撐能力,有利于細胞的增殖和分化。3.在體內(nèi)和體外,MECS都展現(xiàn)出良好的成骨能力以及血管化能力和骨再生、修復效果。為組織工程和骨再生提供了一個新的思路。
【圖文】：

7圖1 骨的九層結(jié)構(gòu)基質(zhì)囊泡中的堿性磷酸酶切割磷酸酯并作為鈣和磷酸鹽沉積的焦點，這一過程有量的非膠原蛋白（NCP）參與[104-106]。無機和有機相的納米級精確排列形成了一個適應性強的功能性生物材料。像許多礦化組織一樣，從納米結(jié)構(gòu)到宏觀，，骨由各種形變和韌化機制增強其抗斷裂能力[107]。作為肌肉-骨骼運動的主要機械支持物，骨骼在整個生命周期中的有效重塑，有利于維持哺乳動物機體骨骼組織的完整性。天然骨主要組成結(jié)構(gòu)從納米到宏觀分為幾個層次[100]，皮質(zhì)骨和骨小梁的外部幾何形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)代表了骨的宏觀和微觀結(jié)構(gòu)水平。皮質(zhì)骨包括哈弗斯小管和細胞。膠原蛋白和羥基磷灰石礦化物作為礦化膠原纖維的主要成分，進一步通過空間結(jié)構(gòu)的組裝形成纖維， 為天然骨骼提供卓越的機械性能和重塑能力。Weiner和Wagner首先提出了層狀骨組織中的7個層次[108]�？紤]到有序和無序成分的存在

基和礦化培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng) 5d。5) 顯微鏡下觀察細胞球生長情況。圖1.1 微孔細胞培養(yǎng)板示意圖表 1.2 礦化 A 液培養(yǎng)基成分 終濃度 品牌α-MEM 培養(yǎng)基 GIBCO胎牛血清 20% GIBCO青霉素/鏈霉素 100U/ml BIOSOURCE谷氨酰胺 2mM BIOSOURCE2-甲氧基雌二醇 55uM GIBCO地塞米松磷酸鈉 55 μM SigmaK2HPO44.2mM 北京化學試劑廠
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08

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