【摘要】：背景:血管生成是大多數(shù)組織發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和再生的關(guān)鍵過程,該過程受促血管生長因子濃度、時空呈現(xiàn)和呈現(xiàn)序列的調(diào)節(jié)。刺激血管生成可促進缺血性疾病的治療,提高移植器官和組織替代物的存活率。為了將促血管生成因子轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用中,產(chǎn)生了無數(shù)基于生物材料的藥物遞送方式。許多技術(shù)都依賴于在水凝膠生物支架中加入生長因子,可以根據(jù)生長因子和支架的理化性質(zhì)進行釋藥控制。課題組建立了一種聲學(xué)響應(yīng)生物支架(Acoustically-responsive scaffolds,ARSs),基本構(gòu)成是在纖維蛋白基質(zhì)中加入載有生長因子的聲學(xué)相變?nèi)閯?前期已證實聚焦超聲可以控制ARSs中生物活性負載的釋放。目的:1.在人臍靜脈內(nèi)皮細胞黏附包裹的微珠和成纖維細胞共培養(yǎng)模型中,探討上層培養(yǎng)基中不同濃度的成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)bFGF對內(nèi)皮血管網(wǎng)生成的影響;2.在無細胞的膠中膠結(jié)構(gòu)模型中,采用不同聲壓輻照內(nèi)層聲學(xué)響應(yīng)支架,檢測bFGF在上層培養(yǎng)基、外層凝膠和內(nèi)層凝膠中的分布情況;3.在膠中膠結(jié)構(gòu)的凝膠中,探討不同聲壓和ARSs相變?nèi)閯┖康那闆r下,釋放bFGF對外層凝膠中血管網(wǎng)生長的影響;同時對比了空白乳劑對血管網(wǎng)生長的影響;4.聚焦超聲以不同輻照模式激勵A(yù)RSs對微血管網(wǎng)生長和成纖維細胞密度的影響。材料和方法:1.主要實驗儀器:(1)超聲換能器H-108產(chǎn)自美國Sonic Concepts公司,為已校準(zhǔn)的單晶片聚焦超聲,頻率為2.5 MHz,f值為0.83,聲學(xué)焦距為50 mm。該換能器由美國Ritec公司的GA-2500A型門控射頻放大器推動,焦點處峰值負壓(Peak rarefractional pressure,PRP)為0-8.8 MPa可調(diào),本實驗中使用該換能器輻照ARSs產(chǎn)生聲致相變(acoustic droplet vaporization,ADV)。(2)庫爾特粒度儀:Multisizer 4,美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)。(3)熒光顯微鏡:Eclipse TiE,美國Nikon公司生產(chǎn)。2.主要實驗試劑與材料:(1)VascuLife VEGF內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基,美國Lifeline Cell Technology公司生產(chǎn)。(2)DMEM細胞培養(yǎng)基,美國Gibco公司生產(chǎn)。(3)DMEM/F12培養(yǎng)基,美國Gibco公司生產(chǎn)。(4)載體微珠,美國Sigma公司生產(chǎn)。(5)牛纖維蛋白原,美國Sigma公司生產(chǎn)。(6)bFGF,美國EMD Millipore公司生產(chǎn)。(7)牛凝血酶,美國King Pharmaceuticals公司生產(chǎn)。(8)荊豆凝集素(Ulex europaeus agglutin I,UEA-I),美國Vector Laboratories公司生產(chǎn)。(9)4′,6-二脒基-2-苯吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI),美國Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)。(10)全氟庚烷(Perfluoroheptane,PFHep),美國Sigma公司生產(chǎn)。(11)bFGF酶聯(lián)免疫吸附試劑盒,美國RD System公司生產(chǎn)。(12)石英微流控芯片,英國Dolomite公司生產(chǎn)。(13)6孔HT雙向應(yīng)力細胞培養(yǎng)板,美國Flexcell International公司生產(chǎn)。3.細胞株:(1)人臍靜脈內(nèi)皮細胞,購于美國Lonza公司;(2)正常人皮膚成纖維細胞,購于美國Lonza公司;4.實驗方法:(1)不同濃度bFGF對微血管網(wǎng)生長的影響:(1)凝膠制備:凝膠組成包括2.5 mg/mL纖維蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶、2.5×10~4個成纖維細胞/mL和50個微珠/mL,其中微珠上包裹有人臍靜脈內(nèi)皮細胞,每10~4個微珠可聯(lián)結(jié)4×10~6個HUVECs,于制備凝膠前一天準(zhǔn)備好;(2)添加培養(yǎng)基:配制凝膠當(dāng)天,使用完全培養(yǎng)基。第二天,陰性對照組的上層培養(yǎng)基更換為饑餓培養(yǎng)基,其他各實驗組,上層培養(yǎng)基更換為包含不同濃度bFGF的饑餓培養(yǎng)基,bFGF濃度分別為0.1 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL或100 ng/mL;(3)成像與分析:第7天或14天固定凝膠以后,分別使用荊豆凝集素和DAPI進行染色,可使用熒光顯微鏡及MetaMorph軟件進行內(nèi)皮血管網(wǎng)的成像及定量分析,使用ImageJ對成纖維細胞數(shù)量進行分析。(2)ADV對bFGF釋放的影響:(1)乳劑制備:使用微流控芯片制作聲學(xué)雙相乳劑,其中W_1相包含10 mg/mL BSA、2μg/mL(即0.4 U/mL)肝素和0.5 mg/mL的bFGF溶液,PFC相為全氟庚烷(沸點82℃);(2)凝膠制備及超聲輻照:內(nèi)層凝膠(0.4 mL)為ARSs,組成包括2.5 mg/mL纖維蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶、0.25%或1%(v/v)含有bFGF的雙相乳劑或相應(yīng)量的bFGF。外層凝膠(1.5 mL)包含2.5 mg/mL纖維蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶和DMEM培養(yǎng)基。待其凝聚后在凝膠上層添加完全培養(yǎng)基。第二天,各實驗組培養(yǎng)基更換為饑餓培養(yǎng)基,并使用計算機控制的聚焦超聲進行輻照(PRP為3.3或8.8 MPa);(3)取材及檢測:超聲輻照前和輻照后8天連續(xù)取材,每次從上層培養(yǎng)基中收取0.1 mL。在第2天或第8天,采用活檢針(?:6 mm)從外層凝膠中取樣,并在樣品中加入0.05 U纖溶酶進行消化。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗來測定樣品中的bFGF濃度。(3)ADV對微血管網(wǎng)生長的影響:(1)乳劑制備:使用微流控芯片制作水相-全氟庚烷(C_7F_(16))微粒-微粒內(nèi)水相的聲學(xué)雙相乳劑,其中W_1相包含10 mg/mL BSA、2μg/mL(即0.4 U/mL)肝素和0.5 mg/mL的bFGF溶液,PFC相為全氟庚烷。制作空白乳劑時,W_1相僅含有PBS;(2)凝膠制備及超聲輻照:內(nèi)層凝膠(0.4 mL)為ARSs,組成包括2.5 mg/mL纖維蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶、0.25%或1%(v/v)含有bFGF的雙相乳劑。外層凝膠(1.5 mL)包含2.5 mg/mL纖維蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶、2.5×10~4個成纖維細胞/mL和75個微珠。待其凝聚后在凝膠上層添加完全培養(yǎng)基。第二天,各實驗組培養(yǎng)基更換為饑餓培養(yǎng)基,并使用聚焦超聲、利用計算機控制進行輻照(聲壓為3.3或8.8MPa);(3)成像與分析:第7天固定凝膠以后,分別使用荊豆凝集素和DAPI進行染色,對內(nèi)皮血管網(wǎng)進行成像及定量分析。(4)ADV對微血管網(wǎng)生長的時間調(diào)控:(1)乳劑制備:使用微流控芯片制作聲學(xué)雙相乳劑,其中W_1相包含10 mg/mL BSA、2μg/mL(即0.4 U/mL)肝素和0.5 mg/mL的bFGF溶液,PFC相為全氟庚烷;(2)凝膠制備及超聲輻照:內(nèi)層凝膠(0.4 mL)為ARSs,組成包括2.5 mg/mL纖維蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶、0.25%或1%(v/v)含有bFGF的雙相乳劑。外層凝膠(1.5 mL)包含2.5 mg/mL纖維蛋白原溶液、2 U/mL凝血酶、2.5×10~4個成纖維細胞/mL和75個微珠。待其凝聚后在凝膠上層添加完全培養(yǎng)基。第二天,各實驗組培養(yǎng)基更換為饑餓培養(yǎng)基。第1天使用PRP=8.8 MPa的超聲輻照ARSs的不同部分(即半個內(nèi)層凝膠或整個內(nèi)層凝膠),在稍后的時間點(即第4天或第7天)用超聲輻照ARSs剩余的半個膠;(3)成像與分析:第7天、第10天或第13天固定凝膠以后,對微血管網(wǎng)進行熒光成像及定量分析,使用ImageJ軟件對成纖維細胞數(shù)量進行分析。結(jié)果:1.不同濃度bFGF對微血管網(wǎng)生長的促進作用:(1)微血管網(wǎng)總長度與bFGF濃度之間呈S型增長關(guān)系。培養(yǎng)14天時,50%效應(yīng)時的bFGF濃度C_(50)為5.9 ng/mL[4.7,7.3],培養(yǎng)7天時,C_(50)為2.7 ng/mL[2.3,3.2],前者顯著高于后者(P?0.05)。類似的,培養(yǎng)14天時血管網(wǎng)總長度最大值L_(max)為14,8008μm[7358,8710],培養(yǎng)7天時L_(max)為7,4303μm[4051,4567],前者顯著高于后者(P?0.05)。(2)與最低濃度bFGF(0.1 ng/mL)相比,bFGF濃度為5 ng/mL及以上時,NHDFs密度顯著性增高(P?0.05),培養(yǎng)14天時,該趨勢更顯著。2.ADV對bFGF釋放的促進作用(1)在PRP 3.3或8.8 MPa的超聲輻照后,釋放入上層培養(yǎng)基的bFGF比例顯著增加(P?0.05),無超聲輻照組釋放量可忽略不計(即?0.02%)。在同樣的乳劑濃度情況下,bFGF釋放量與聲壓相關(guān),在PRP 8.8 MPa輻照時,含1%乳劑的ARSs比0.25%組釋放出更多的bFGF(P?0.05);當(dāng)PRP 3.3 MPa輻照時,二者則無顯著性差異(P0.05);(2)bFGF直接存在于內(nèi)層凝膠中時,對于含有167 ng和668 ng bFGF的凝膠,bFGF釋放最大百分比C_(max)分別為23.5%[22.4,24.7]和22.1%[21.2,23.1](P?0.05),速率常數(shù)K分別為1.1天~(-1)[0.8,1.6]和0.9天~(-1)[0.7,1.2](P?0.05);(3)通過檢測bFGF在系統(tǒng)中的分布可知,大部分添加的bFGF仍存留于內(nèi)層凝膠中,同時,比較第2天與第8天結(jié)果時,發(fā)現(xiàn)所有組內(nèi)層凝膠或培養(yǎng)基中的bFGF均有所增長。3.ADV對微血管網(wǎng)生長的促進作用:(1)載有bFGF的全氟庚烷乳劑微粒粒徑測量結(jié)果:乳劑平均值為6.2±0.13μm,變異系數(shù)為13.4%±0.6%;(2)空白乳劑對血管生成的影響:對于空白乳劑,在沒有bFGF遞送的情況下,ARSs中ADV的發(fā)生對血管網(wǎng)生長有顯著的促進作用(P?0.05),但作用有限。其中完全培養(yǎng)基中生長的微血管網(wǎng)長度(4235±1816μm)比饑餓培養(yǎng)基中的(258±77μm)高16倍(P?0.05);(3)ADV促進微血管網(wǎng)生長:與饑餓培養(yǎng)基條件相比,無超聲輻照組和PRP 3.3 MPa輻照0.25%(v/v)乳劑組的微血管網(wǎng)無顯著增加(P0.05),而PRP 3.3 MPa輻照1%(v/v)乳劑組、PRP 8.8 MPa輻照0.25%(v/v)乳劑組和PRP 8.8 MPa輻照1%(v/v)乳劑組微血管網(wǎng)長度均顯著增加(P?0.05)�？偠灾�,微血管網(wǎng)生長與ARSs中載有bFGF乳劑的含量和用于釋放bFGF的聲壓有關(guān)。4.ADV時間調(diào)控bFGF的釋放對微血管網(wǎng)生長的影響(1)在特定條件下,培養(yǎng)時間越長,血管網(wǎng)總長度越長。所有超聲輻照組血管網(wǎng)均顯著長于無超聲輻照組。然而,在相同的培養(yǎng)時間下,不同的輻照方式間(即全部一次性輻照或分批輻照)無顯著性差異(P?0.05)。NHDFs亦觀察到類似的趨勢(P?0.05);(2)通過對微血管網(wǎng)總長度和微珠離ARS距離基于斜率的分析,顯示二者無相關(guān)性(P?0.05)。結(jié)論:1.微血管網(wǎng)長度與上層培養(yǎng)基中bFGF的濃度呈S型相關(guān),且成纖維細胞密度也隨著bFGF濃度增加而增大。2.將bFGF直接添加入纖維蛋白的內(nèi)層凝膠時,可觀察到突釋現(xiàn)象。ARS中含有等量的乳劑時,bFGF釋放量與輻照聲壓相關(guān),即聲壓越大,bFGF釋放入上層培養(yǎng)基的量越大。采用高聲壓輻照時,bFGF釋放入培養(yǎng)基中的速率與ARS中乳劑含量呈反比,這可能是由于氣泡形成使bFGF的擴散路徑更長。3.乳劑中含有bFGF時,ARS中氣泡的形成、外層凝膠中的血管網(wǎng)生長與ARS中載有bFGF乳劑的含量和用于產(chǎn)生ADV的聲壓有關(guān)�？瞻兹閯⿲�(nèi)皮血管網(wǎng)的生長也有輕微的促進作用。4.聚焦超聲在不同時間點或輻照不同范圍的ARS,使其釋放出不同劑量的bFGF,結(jié)果顯示該方式對血管網(wǎng)生長無明顯影響。結(jié)合劑量依賴曲線,原因可能是給藥量不足。
【圖文】：

(5) 統(tǒng)計學(xué)分析使用 GraphPad Prism 軟件進行統(tǒng)計分析。獨立重復(fù)的次數(shù)列在每個圖的圖注中。采用單因素方差分析和 Turkey 多重比較法確定組間的差異是否顯著，顯著性水平為0.05。使用四參數(shù) Logistic 函數(shù)來擬合血管網(wǎng)總長度和 bFGF 濃度的關(guān)系，，其中血管網(wǎng)總長度最大值為 Lmax，血管網(wǎng)總長度最小值為 Lmin，達到血管網(wǎng)總長度最大值的一半時對應(yīng)的 bFGF 濃度為 C50。參數(shù)的 95%置信區(qū)間以 S[SL, SH]表示，S 為平均值，SL為下限值，SH為上限值。2.3 結(jié) 果內(nèi)皮血管網(wǎng)的MP圖像示例，包括分段圖像，如圖1所示。從內(nèi)皮細胞包裹的微珠表面產(chǎn)生的管樣結(jié)構(gòu)以及NHDFs均存在于纖維蛋白水凝膠中。

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文血管網(wǎng)的長度均顯著增大。與培養(yǎng) 7 天相比，培養(yǎng) 14 天時，10 ng/mL 和 100 ng/mL的 bFGF 濃度可產(chǎn)生顯著增長的血管網(wǎng)。培養(yǎng) 14 天時，50%效應(yīng)時的 bFGF 濃度 C50為 5.9 ng/mL [4.7, 7.3]，培養(yǎng) 7 天時，C50為 2.7 ng/mL [2.3, 3.2]，前者顯著高于后者。類似的，培養(yǎng) 14 天時血管網(wǎng)總長度最大值 Lmax為 8008 μm [7358, 8710]，培養(yǎng) 7 天時Lmax為 4303 μm [4051, 4567]，前者顯著高于后者。比較培養(yǎng) 7 天和培養(yǎng) 14 天的血管網(wǎng)總長度最小值 Lmin，二者無統(tǒng)計學(xué)差異。如圖 2B 所示，與最低濃度 bFGF（0.1 ng/mL）相比，bFGF 濃度為 5 ng/mL 及以上時，NHDFs 密度顯著性增高。另外，與培養(yǎng) 7 天相比，培養(yǎng) 14 天 bFGF 濃度為 5 ng/mL 及以上時，NHDFs 密度顯著性增高。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R318

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本文編號：2637934