【摘要】：研究目的以多種魚類魚骨為原料,通過高溫煅燒篩選能制備出含有HA/β-TCP雙相磷酸鈣(BCP,Biphasic calcium phosphate)成分的魚類,研究不同煅燒溫度對(duì)魚骨來(lái)源BCP成分和結(jié)構(gòu)的影響,并深入探討魚骨通過煅燒能夠產(chǎn)生BCP的原因。通過一系列簡(jiǎn)便可行的方法制備一類魚骨來(lái)源的BCP多孔陶瓷骨支架材料,并對(duì)其成分、結(jié)構(gòu)、細(xì)胞毒性以及動(dòng)物體內(nèi)的生物相容性以及骨誘導(dǎo)性能進(jìn)行研究。通過本課題的研究,為將來(lái)新型骨缺損修復(fù)材料的研制和臨床使用奠定基礎(chǔ)。研究方法實(shí)驗(yàn)一高溫煅燒法篩選并制備魚骨來(lái)源BCP。以鮭魚、裸蓋魚、沙丁魚、烏鱧、鯽魚、巴沙魚6種魚類魚骨為原料,采用高溫煅燒法結(jié)合XRD分析,篩選出煅燒后能夠產(chǎn)生HA/β-TCP雙相磷酸鈣成分的魚類。通過改變煅燒溫度,利用XRD、FTIR和SEM對(duì)不同煅燒溫度下生成的魚骨來(lái)源BCP進(jìn)行表征,研究煅燒溫度對(duì)生成的BCP成分、晶粒尺寸和微觀結(jié)構(gòu)的影響,為下一步制備魚骨來(lái)源BCP多孔陶瓷骨支架材料確定最佳的煅燒溫度。利用TGA研究魚骨煅燒過程中的熱穩(wěn)定性和組分變化。采用ICP-OES和XRF對(duì)魚骨來(lái)源BCP的Ca/P比及微量元素進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)二魚骨來(lái)源BCP多孔陶瓷骨支架材料的制備、表征與細(xì)胞毒性。通過煅燒、過篩、清洗、干燥、消毒等一系列工藝制備魚骨來(lái)源BCP多孔陶瓷骨支架材料,利用SEM、壓汞儀、比表面積儀等設(shè)備對(duì)支架材料的三維空間孔隙結(jié)構(gòu)和微觀表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。提取和培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs),依據(jù)國(guó)標(biāo)GBT_16886.5-2003制備材料的浸提液,將hBMSCs與材料浸提液共培養(yǎng)1、3、5天,利用CCK-8法和Live/dead染色法檢測(cè)材料對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。在小鼠一側(cè)臀部肌群構(gòu)建肌袋異位成骨模型,將制備出的材料植入肌袋。術(shù)后8周處死動(dòng)物,將材料連同周圍部分組織取出制作石蠟切片,通過HE和Masson染色再次明確動(dòng)物體內(nèi)的生物相容性,并對(duì)支架材料的骨誘導(dǎo)性能進(jìn)行初步探索。研究結(jié)果實(shí)驗(yàn)一經(jīng)過高溫煅燒,只有鮭魚、裸蓋魚、沙丁魚三種魚骨能生成主要成分為HA和β-TCP的雙相磷酸鈣產(chǎn)物。當(dāng)煅燒溫度從600℃到1100℃變化時(shí),發(fā)現(xiàn):三種魚骨在700℃或以上的溫度煅燒就能夠生成BCP,β-TCP含量根據(jù)魚類和煅燒溫度的不同在12.1%到49.0%之間變化,Ca/P比在1.5-1.67之間,同時(shí)還存在碳酸化羥基磷灰石和多種微量元素。隨著煅燒溫度的升高,大部分有機(jī)成分被去除,當(dāng)煅燒溫度超過900℃時(shí),碳酸化羥基磷灰石成分消失。煅燒溫度的升高還會(huì)引起B(yǎng)CP晶粒尺寸不斷增大并影響顆粒間介孔結(jié)構(gòu)。因此,800-900℃為煅燒鮭魚、沙丁魚、裸蓋魚魚骨的最佳溫度。實(shí)驗(yàn)二通過高溫煅燒、過篩、清洗干燥、滅菌等一系列簡(jiǎn)便可行的制備工藝,我們將鮭魚、裸蓋魚、沙丁魚三種魚骨轉(zhuǎn)化成BCP多孔陶瓷骨支架材料(鮭魚在900℃煅燒命名為Sa 900,裸蓋魚在800℃煅燒命名為An 800,沙丁魚在900℃煅燒命名為Sd 900)。通過對(duì)三種支架材料的成分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn),Sa 900具有最多的β-TCP成分,達(dá)到49.0%,An 800具有較多的開放大孔和最高的總孔隙率,達(dá)到74.8%,Sd 900具有最高的比表面積,達(dá)到23.527m~2g~(-1)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和Live/dead細(xì)胞染色證實(shí)三種材料不僅對(duì)細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性,其中Sa 900還對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有一定的促增殖作用。利用小鼠肌內(nèi)異位成骨模型,通過HE和Masson染色,觀察到Sa 900、An 800、Sd 900三種材料周圍和內(nèi)部孔隙內(nèi)均有成骨細(xì)胞樣細(xì)胞出現(xiàn)和類骨質(zhì)形成。雖然未見新生骨組織生成,但本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還是可以說(shuō)明本課題制備的三種魚骨來(lái)源BCP多孔骨支架材料具備一定的促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分化的骨誘導(dǎo)性能。結(jié)論通過高溫煅燒并結(jié)合XRD分析,發(fā)現(xiàn)鮭魚、裸蓋魚和沙丁魚三種魚類在800-900℃煅燒時(shí),魚骨中有機(jī)物大部分被去除,生成的BCP產(chǎn)物所含β-TCP成分較多,且保留了碳酸化羥基磷灰石和多種微量元素,所形成的BCP晶粒尺寸大小均勻,晶體結(jié)晶度高,并存在均勻分布的天然納米級(jí)介孔結(jié)構(gòu)。采用這三種魚骨為原料,通過高溫煅燒、過篩、清洗干燥、滅菌等一系列制備工藝,將魚骨轉(zhuǎn)化成具有HA/β-TCP雙相磷酸鈣成分的多孔陶瓷支架材料,保留了魚骨原有的天然三維孔隙結(jié)構(gòu),具有較高的孔隙率和比表面積,通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這三種材料具備良好的生物相容性,并通過小鼠肌內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三種魚骨來(lái)源BCP多孔骨支架材料具備一定程度的骨誘導(dǎo)性能,具有成為一種新型臨床醫(yī)用骨支架材料的可能性。
【圖文】：

（四）熱重分析將步驟（二）篩選出的魚類未煅燒魚骨干燥后放入熱重分析儀（TGA），將樣品從室溫加熱到 1000℃，升溫速率為 10℃/min，以檢測(cè)各類魚骨溫度-質(zhì)量變化關(guān)系，輔助成分分析。（五）Ca/P 比及微量元素分析通過 X 射線熒光光譜分析（XRF)和電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES），測(cè)定步驟（二）篩選出的魚類在 900℃煅燒出的骨塊 Ca/P 比和其他微量元素含量百分比。四、研究結(jié)果（一) 魚骨來(lái)源 BCP 的篩選如圖 1.1 所示，6 種魚魚骨通過 1000℃的高溫煅燒后，烏鱧、鯽魚和巴沙魚這三

制備 BCP 多孔骨支架材料的原料。（二）煅燒溫度對(duì)魚骨來(lái)源 BCP 成分和結(jié)構(gòu)的影響1.物相和結(jié)晶度分析圖 1.2 為不同燒結(jié)溫度制備的魚類來(lái)源 BCP 的 XRD 圖譜。從 XRD 圖譜中可以看到，，三種魚骨煅燒前成分均為 HA （JCPDS No.72-1243），未出現(xiàn)其他成分的衍射峰。此時(shí)衍射峰寬而短， HA 結(jié)晶度低，晶粒尺寸小。隨著煅燒溫度的升高，HA 的衍射峰呈現(xiàn)出窄而尖的變化趨勢(shì)，提示 HA 的結(jié)晶度隨著煅燒溫度的變化而升高，晶粒尺寸也在不斷增大，體現(xiàn)了晶體在高溫煅燒過程中的聚合增長(zhǎng)現(xiàn)象。在 600-1100℃的煅燒過程中（600、800、1000℃三個(gè)溫度的圖未顯示），鮭魚、裸蓋魚、沙丁魚煅燒骨從 700℃開始出現(xiàn) β-TCP（JCPDS No.70-2065）成分，且隨著煅燒溫度的變化，HA 和 β-TCP 的含量比也發(fā)生變化。除 HA 和 β-TCP 以外，XRD 衍射圖中未能檢測(cè)出現(xiàn)其他的微量成分，因此將煅燒產(chǎn)物當(dāng)成雙相成分進(jìn)行定量分析。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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1 Jan Henkel;Maria A.Woodruff;Devakara R.Epari;Roland Steck;Vaida Glatt;Ian C.Dickinson;Peter F.M.Choong;Michael A.Schuetz;Dietmar W.Hutmacher;;Bone Regeneration Based on Tissue Engineering Conceptions  A 21st Century Perspective[J];Bone Research;2013年03期

本文編號(hào)：2637863