【摘要】：組織工程皮膚在臨床皮膚再生修復(fù)、化學(xué)品安全毒理與功效測試以及皮膚疾病研究等領(lǐng)域均有重要的應(yīng)用。特別是歐美動物替代測試的推廣,已造成貿(mào)易壁壘,嚴(yán)重影響我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展,迫切需要有效且簡便的方法構(gòu)建組織結(jié)構(gòu)與功能與人體皮膚更加相近的組織工程皮膚。支架材料選擇、支架制備、種子細(xì)胞與構(gòu)建方法是組織工程皮膚構(gòu)建的技術(shù)要點。成纖維細(xì)胞在支架中均勻分布、增殖生長、活性保持情況,角質(zhì)細(xì)胞在支架上增殖與分化情況以及構(gòu)建得到的組織結(jié)構(gòu)完整性與功能等,都是全層皮膚構(gòu)建成敗的關(guān)鍵評價標(biāo)準(zhǔn)�；谔烊辉仙锵嗳菪院�,細(xì)胞毒性小等優(yōu)點,我們在組織工程皮膚的構(gòu)建中選用了海藻酸鈉、殼聚糖、膠原、明膠和纖維蛋白作為支架材料。首先利用冷凍干燥法得到了海藻酸鈉體積占比100%、60%與20%的海藻酸鈉-殼聚糖多孔支架A1、A2和A3,用0.25%戊二醛、0.02M EDC/NHS交聯(lián)和二次凍干法制得的膠原-殼聚糖支架B1、B2和B3及冷凍干燥后熱交聯(lián)得到明膠支架C1。通過吸水率與孔隙率測試、支架形貌結(jié)構(gòu)觀察及對接種成纖維細(xì)胞的支架的三維空間細(xì)胞分布與增殖情況進(jìn)行對比,分析不同多孔支架的性能。最終選用吸水率和孔隙率分別大于80%和90%,表面孔徑在70-150μm之間且成纖維細(xì)胞可在支架中均勻分布并增殖即性能最佳的明膠支架C1進(jìn)行全層皮膚構(gòu)建,獲得了具有完整真表皮結(jié)構(gòu),全皮與表皮厚度分別在1000-1100μm之間與50-250μm之間且可正常表達(dá)表皮層標(biāo)記蛋白角蛋白10的全層皮膚。由于冷凍干燥法獲得的多孔支架在構(gòu)建全層皮膚過程中,常需成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)填充多孔結(jié)構(gòu)后再接種角質(zhì)細(xì)胞,構(gòu)建周期較長且厚度大的真皮結(jié)構(gòu),成纖維細(xì)胞接種后較難分布均勻。進(jìn)而我們基于成纖維細(xì)胞在不同濃度的纖維蛋白水凝膠的增殖和活性測試結(jié)果以及機械性能,最終選用濃度為5 mg/m L的纖維蛋白水凝膠進(jìn)行全層皮膚構(gòu)建,獲得了具有完整真表皮結(jié)構(gòu)且角蛋白10從第7天到第14天表達(dá)量不斷上升的全層皮膚。最后我們利用纖維蛋白凝膠以及靜電紡絲制得的可使角質(zhì)細(xì)胞有效粘附、增殖與分化的明膠纖維支架,在PEGDA組織培養(yǎng)小室中進(jìn)行全層皮膚構(gòu)建。并對通過微流控芯片與自動培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建流體環(huán)境,模擬體內(nèi)養(yǎng)分供給與代謝產(chǎn)物去除的動態(tài)過程構(gòu)建得到的全層皮膚與采用傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)方式構(gòu)建得到的全層皮膚進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)與活性以及屏障功能形成情況的對比研究。實驗結(jié)果表明培養(yǎng)八天后,兩種構(gòu)建方式均能獲得具有完整真表皮結(jié)構(gòu)的全層皮膚.第六天全層皮膚均保持組織活性,活細(xì)胞較多。動態(tài)構(gòu)建相比靜態(tài)構(gòu)建方式獲得的全層皮膚,死細(xì)胞少,但厚度相對較薄。從皮膚屏障測試可知,兩種構(gòu)建方式得到的全層皮膚第六天與第一天相比,阻值明顯上升,均能得到具有一定皮膚屏障功能的全層皮膚。本研究通過不同支架構(gòu)建得到的具有完整真表皮結(jié)構(gòu)的全層皮膚,有很強的應(yīng)用潛力,可進(jìn)一步在皮膚再生修復(fù)、皮膚疾病的研究、藥物篩選與化妝品安全毒理與功效評價等應(yīng)用方向上開展研究。其中采用纖維蛋白凝膠作為支架對全層皮膚組織結(jié)構(gòu)與功能的完善提供了有利的條件。動態(tài)環(huán)境構(gòu)建全層皮膚的方法為進(jìn)一步提升組織工程皮膚培養(yǎng)環(huán)境,開展皮膚相關(guān)的多器官共培養(yǎng)研究提供了有效的技術(shù)支撐。
【圖文】：

皮膚是人體與外界環(huán)境的一個重要屏障，也是人體最大的器官，可避免體內(nèi)水分過量流失，還具有溫度調(diào)節(jié)、感覺、隔熱等功能[2]。皮膚由表皮、真皮與皮下組織構(gòu)成。表皮主要由上皮細(xì)胞和樹狀細(xì)胞組成，上皮細(xì)胞來源于外胚層，其發(fā)生和分化最終階段是形成含有角蛋白的角質(zhì)細(xì)胞，故又稱角質(zhì)細(xì)胞，而樹狀細(xì)胞主要包括朗格罕斯細(xì)胞和黑色素細(xì)胞。角質(zhì)細(xì)胞由于不同分化階段以及特點，又可以分為五層，從表面到底部為角質(zhì)層、透明層、顆粒層、棘層和基底層。真皮是表皮和皮下組織的連接層，是皮膚重要的組成部分，主要由成纖維細(xì)胞以及膠原纖維、彈性纖維、透明質(zhì)酸、纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)組成。皮膚中還有毛、指（趾）、皮膚腺和汗腺，是胚胎發(fā)生時由表皮衍生的附屬結(jié)構(gòu)，稱皮膚附屬器或表皮附屬器，此外皮膚還有豐富的血管、淋巴管和肌肉和神經(jīng)。表皮厚度在 0.04-1.6 mm 之間，其中眼瞼最薄為 0.04 mm，真皮厚度為表皮的 15-40 倍，，0.4-2.4 mm 不等[3]。

圖 1-2 2D 與 3D 環(huán)境中細(xì)胞形態(tài)圖A） 細(xì)胞粘附、形貌、機械性能和可溶性在 2D 和 3D 環(huán)境中的示意圖[6]；B）成纖維細(xì)胞在膠原鋪被上與在膠原凝膠中以及被諾考達(dá)唑干預(yù)后去極化的細(xì)胞形貌[7]Fig.1-2 Cell morphology cultured in 2D and 3D situationsA）Adhesive, topographical, mechanical, and soluble cues in 2D and 3D[6]；B) Morphology ofibroblasts cultured on collagen coating dish and collagen gel[7].隨著動物實驗的替代（Replacement）、減少（Reduction）、優(yōu)化（Refinement原則即 3R 原則的提出與發(fā)展，以及組織工程皮膚領(lǐng)域研究的深入、相關(guān)技術(shù)的成熟與法規(guī)的推進(jìn)，與皮膚相關(guān)的動物實驗逐漸被組織工程皮膚所替代。同時由于組織工程皮膚為細(xì)胞間通訊提供三維環(huán)境而基質(zhì)環(huán)境對細(xì)胞增殖、分化、色素沉積有直接影響。此外，表皮與真皮的遺傳特征可以在體外實現(xiàn)改變，有利于機制與信號通路方面的研究，也成為研究光老化、皮膚癌、皮膚浮腫等皮膚疾病與藥物開發(fā)的有效工具。歐盟、美國、日本、韓國等國家都建立了體外研究中心如ECVAM、JCVAM 與 ICCVAM，許多國外的化妝品公司也加大在該領(lǐng)域的投入
【學(xué)位授予單位】：廣東工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王軍,李新松,趙艷秋,浦躍樸;殼聚糖多孔支架的制備與生物學(xué)性質(zhì)[J];東南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2004年01期

2 吳林波,丁建東;組織工程三維多孔支架的制備方法和技術(shù)進(jìn)展[J];功能高分子學(xué)報;2003年01期

本文編號：2635721