【摘要】：研究背景人工真皮能有效修復(fù)累及真皮層的損傷,促進(jìn)創(chuàng)面愈合,改善愈合后功能和外觀。目前臨床上使用的人工真皮多為雙層結(jié)構(gòu),如Intgra、Pelanc等,主要由作為生長支架的膠原層和具有屏障功能的硅膠層兩層結(jié)構(gòu)構(gòu)成。這些人工真皮主要作用于經(jīng)清創(chuàng)等處理徹底清除壞死組織,且未發(fā)生感染的創(chuàng)面,因為人工真皮移植失敗的主要原因是移植后感染。移植后感染多發(fā)生于移植后早期,該時期內(nèi),由人工真皮未能與創(chuàng)面建立良好的血供,抗菌能力較弱,且隨著創(chuàng)面細(xì)菌侵入、增殖,細(xì)菌分泌膠原酶,降解人工真皮的膠原層,降解產(chǎn)物成為細(xì)菌增殖的良好培養(yǎng)基,進(jìn)一步增加了其移植后感染風(fēng)險。移植后一旦發(fā)生感染,不但會造成移植失敗,還可能引發(fā)膿毒血癥,威脅患者生命。移植前徹底清創(chuàng)、移植后加強(qiáng)換藥、全身使用抗生素等一系列抗菌措施應(yīng)用于預(yù)防人工真皮移植后感染的問題,雖然取得了一定成效,但仍無法避免移植后感染的出現(xiàn)。已有大量研究將各種生長因子加入人工真皮,以期進(jìn)一步促進(jìn)創(chuàng)面愈合,借鑒于此,有研究將抗菌成分加入其中以期研制一種本身就具有一定抗菌能力的人工真皮將為改善人工真皮移植后感染問題提供新的思路和方法,也將拓展人工真皮適用范圍,為創(chuàng)面治療提供更多的選擇。本研究選擇國內(nèi)Lando?雙層人工真皮修復(fù)材料作為基礎(chǔ)人工真皮,篩選合適的臨床抗菌制劑,進(jìn)行人工真皮的抗菌修飾,并驗證其持續(xù)抗菌能力及促創(chuàng)面愈合的效果。第一部分:賦予人工真皮持續(xù)抗菌能力的抗菌成分選擇目的:選擇一種具有較強(qiáng)抗菌能力的抗菌制劑,作為后續(xù)研究賦予人工真皮抗菌能力的成分。方法:選擇臨床創(chuàng)面消毒常用消毒劑作為備選抗菌制劑,本研究所選擇消毒劑包括:碘伏、洗必泰、新潔爾滅、PHMB、復(fù)合溶菌酶、呋喃西林。采用微量肉湯法測定創(chuàng)面常見細(xì)菌菌種(金黃色葡萄球菌、鮑氏不動桿菌、肺炎克雷伯菌)標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株(各20株)對以上消毒劑的MIC、MBC,以消毒劑臨床應(yīng)用于創(chuàng)面的濃度作為消毒劑初始濃度,計算MIC、MBC分別為消毒劑初始濃度的稀釋倍數(shù),記為MIC_(稀釋)、MBC_(稀釋)。比較臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株對同一消毒劑的MIC、MBC,將MIC和/或MBC大于標(biāo)準(zhǔn)菌株的臨床菌株認(rèn)為是對該消毒劑敏感性降低的菌株,計算敏感性降低菌株百分比,初步判斷臨床菌株對各消毒劑的敏感性情況。選擇具有較小MIC_(稀釋)和MBC_(稀釋)且臨床菌株對其具有較高敏感性的消毒劑成分作為本次研究的候選抗菌制劑,用以下一階段實(shí)驗制備具有抗菌能力的人工真皮。結(jié)果:金黃色葡萄球菌對碘伏、洗必泰、新潔爾滅、PHMB、復(fù)合溶菌酶、呋喃西林的MIC_(稀釋)分別為2~(-5)、2~(-6)、2~(-6)、2~(-7)、2~(-6)、2~(-1),MBC_(稀釋)分別為2~(-5)、2~(-5)、2~(-6)、2~(-7)、2~(-6)、-(MBC大于創(chuàng)面常用濃度),敏感性降低菌株百分比分別為30%、30%、55%、5%、5%、50%。鮑氏不動桿菌對碘伏、洗必泰、新潔爾滅、PHMB、復(fù)合溶菌酶、呋喃西林的MIC_(稀釋)分別為2~(-4)、2~(-4)、2~(-5)、2~(-5)、2~(-2)、2~(-1),MBC_(稀釋)分別為2~(-3)、2~(-4)、2~(-4)、2~(-5)、2~(-1)、-(MBC大于創(chuàng)面常用濃度),敏感性降低菌株百分比分別為40%、25%、60%、10%、45%、55%。肺炎克雷伯菌對碘伏、洗必泰、新潔爾滅、PHMB、復(fù)合溶菌酶、呋喃西林的MIC_(稀釋)分別為2~(-4)、2~(-6)、2~(-6)、2~(-7)、2~(-2)、2~(-1),MBC_(稀釋)分別為2~(-4)、2~(-5)、2~(-6)、2~(-7)、2~(-1)、-(MBC大于創(chuàng)面常用濃度),敏感性降低菌株百分比分別為35%、20%、40%、10%、40%、45%。結(jié)論:金黃色葡萄球菌、鮑氏不動桿菌、肺炎克雷伯菌對PHMB具有較小MIC_(稀釋)、MBC_(稀釋),且臨床菌株對其敏感性較高,故PHMB被選擇為賦予人工真皮持續(xù)抗菌能力的抗菌成分。第二部分:具有抗菌能力的人工真皮的制備及性狀檢測目的:以PHMB作為抗菌成分,分別采用浸泡法、微球法、夾層法處理人工真皮,檢測3種方法處理后的人工真皮可持續(xù)抗菌時長,并檢測相關(guān)性狀。方法:將人工真皮分別進(jìn)行如下處理:1.浸泡法:分別浸泡于0.1%、0.5%、1%、2%濃度PHMB溶液中24 h;2.微球法:制作直徑50μm、100μm的明膠微球,每種直徑明膠微球各自分別含0.1%、0.5%、1%、2%PHMB,將人工真皮浸泡于上述明膠微球水溶液中24 h;3.夾層法:制作含0.1%、0.5%、1%、2%PHMB的水凝膠,加入人工真皮的硅膠層和膠原層之間。分別將制備好的實(shí)驗樣品制成直徑5mm的圓形,放置于涂抹金黃色葡萄球菌、鮑氏不動桿菌、肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)皿,每天更換新的涂抹細(xì)菌的培養(yǎng)皿,記錄每天形成得抑菌圈大小,分析各方法可持續(xù)形成有效抑菌圈時間。選擇具有最長可持續(xù)形成有效抑菌圈時間且PHMB濃度較低的實(shí)驗樣品用于后續(xù)研究,檢測性狀。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗,以未加入抗菌成分的人工真皮作為對照,分別觀察實(shí)驗樣品和未加入抗菌成分的人工真皮在第3、7、14、21 d對人成纖維細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響。體外自然降解實(shí)驗,觀察在自然環(huán)境下實(shí)驗樣品降解情況。體內(nèi)埋植實(shí)驗,將實(shí)驗樣品埋入大鼠皮下,觀察埋入部位大體反應(yīng),并記錄降解情況。掃描電子顯微鏡觀察,比較實(shí)驗樣品和未加入抗菌成分的人工真皮結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果:使用浸泡法制備的不同濃度的實(shí)驗樣品對各菌種僅在浸泡后0 d形成了有效抑菌圈;使用微球法制備的實(shí)驗樣品對3個菌種最長可持續(xù)形成有效抑菌圈時間均為1d,由浸泡于直徑50μm、PHMB濃度為1%和2%的明膠微球溶液后形成;使用夾層法,1%和2%PHMB水凝膠加入人工真皮后對金黃色葡萄球菌、鮑氏不動桿菌、肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株可持續(xù)形成有效抑菌圈時間分別為8 d、7 d、7 d。綜合分析1%PHMB水凝膠加入人工真皮膠原層和硅膠層間可作為賦予人工真皮持續(xù)抗菌能力的方法,行下一步研究檢測性狀。細(xì)胞毒性實(shí)驗結(jié)果顯示,具有抗菌能力的人工真皮對人成纖維細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率產(chǎn)生影響較小,與不含抗菌成分的人工真皮比較無明顯差異,P0.05。體外自然降解實(shí)驗顯示,1%PHMB水凝膠降解率較低,至第6周時降解率為27.388±1.943%。體內(nèi)埋植實(shí)驗顯示,1%PHMB水凝膠埋入部位未出現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng),切口生長較好,水凝膠至第3周降解率為23.648±2.336%。掃描電子顯微鏡檢查結(jié)果顯示,加入1%PHMB水凝膠后,人工真皮膠原層結(jié)構(gòu)無明顯改變,膠原層孔隙內(nèi)可觀察到PHMB晶體分布。結(jié)論:1%PHMB水凝膠加入人工真皮膠原層和硅膠層間,能有效賦予人工真皮較長時間持續(xù)抗菌能力,生物毒性較低,降解較慢,且不改變?nèi)斯ふ嫫つz原層原結(jié)構(gòu)。第三部分:具有抗菌能力的人工真皮的在體效果驗證目的:驗證加入1%PHMB水凝膠的人工真皮對創(chuàng)面愈合的影響以及抗菌能力。方法:清潔創(chuàng)面移植實(shí)驗:取40只SD大鼠,制備全層皮膚缺損創(chuàng)面模型,隨機(jī)分為2個組,分別為人工真皮組(Artificial Dermis Group,ADG)、具有抗菌能力的人工真皮組(Anti-infection Artificial Dermis Group,AADG),各組創(chuàng)面分別給予不做特殊處理、覆蓋人工真皮、覆蓋1%PHMB水凝膠、覆蓋具有抗菌能力的人工真皮,分別于第3、7、14、21 d換藥,觀察創(chuàng)面愈合及感染情況,計算每次換藥時的新發(fā)感染率。換藥時每組大鼠隨機(jī)選取5只大鼠處死,取創(chuàng)面組織,分別行病理切片HE染色和CD31免疫組化,計算微血管密度(Micro-vascular Density,MVD),并行創(chuàng)面組織細(xì)菌定量實(shí)驗。感染創(chuàng)面移植實(shí)驗:取20只SD大鼠,隨機(jī)分為人工真皮組2(Artificial Dermis Group,ADG)、具有抗菌能力的人工真皮組(anti-infection Artificial Dermis Group,AADG),每組10只,制備感染創(chuàng)面模型,ADG2覆蓋人工真皮,AADG覆蓋具有抗菌能力的人工真皮。于第3、7、14、21 d換藥,觀察創(chuàng)面感染情況,計算每次換藥時的感染率,于21 d換藥時處死所有大鼠,取創(chuàng)面組織行細(xì)菌定量實(shí)驗。移植后持續(xù)暴露于感染環(huán)境實(shí)驗:取20只SD大鼠,隨機(jī)分為人工真皮組(Artificial Dermis Group,ADG)、具有抗菌能力的人工真皮組3(anti-infection Artificial Dermis Group,AADG),每組10只,制備全層皮膚缺損創(chuàng)面模型,ADG覆蓋人工真皮,AADG覆蓋具有抗菌能力的人工真皮,每日于硅膠層外滴注1mL鮑氏不動桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株細(xì)菌懸液,于移植后3、6、9、12 d換藥觀察創(chuàng)面感染情況,計算每次換藥時的感染率。結(jié)果:清潔創(chuàng)面移植實(shí)驗:ADG于第7 d換藥時出現(xiàn)1個感染創(chuàng)面,新發(fā)感染率均為6.67%。AADG在第3 d MVD少于ADG,P0.05,但后期AADG與ADG的微血管密度間無明顯差異,P0.05。排除感染創(chuàng)面后,各組未感染創(chuàng)面細(xì)菌含量檢測,第3、7、14 d AADG創(chuàng)面組織細(xì)菌含量明顯少于ADG,P0.05。感染創(chuàng)面移植實(shí)驗:移植于感染創(chuàng)面后,ADG所有創(chuàng)面感染癥狀始終無緩解,感染率持續(xù)為100%,第3 d AADG有7個創(chuàng)面感染癥狀消失,仍有3個創(chuàng)面感染癥狀在換藥期間始終無明顯緩解,感染率持續(xù)為30%,明顯低于ADG,P0.05,第21 d取創(chuàng)面組織行細(xì)菌定量實(shí)驗,AADG無論是未感染創(chuàng)面還是感染創(chuàng)面組織細(xì)菌含量明顯低于ADG,P0.05。移植后持續(xù)暴露于感染環(huán)境實(shí)驗:ADG在第6 d所有創(chuàng)面出現(xiàn)感染,AADG在第12 d所有創(chuàng)面出現(xiàn)感染,在第3、6 d兩組間感染率有明顯差異,P0.05。結(jié)論:具有抗菌能力的人工真皮對創(chuàng)面愈合影響較小,移植于感染創(chuàng)面后能有效控制感染,且對移植后可能導(dǎo)致創(chuàng)面感染的因素具有一定抵抗能力。
【圖文】：

（三） 3.夾層法夾層法制備具有抗菌能力的人工真皮實(shí)驗樣品見圖 2-1。PHMB 水凝膠透明，厚度未 1-1.5mm，質(zhì)韌。將其加入人工真皮硅膠層和膠原層后，制凝膠人工真皮，褐色，半透明，3 層結(jié)構(gòu)間未進(jìn)行粘合，各層結(jié)構(gòu)貼附尚度 PHMB 水凝膠的人工真皮在不同時間形成抑菌圈大小見表 2-5。0.1%au、aba、kpn 可持續(xù)形成有效抑菌圈時長分別為 4、3、4 d，0.5%濃度時、5 d，1%濃度時分別為 8、7、7 d，2%濃度時分別為 8、7、7 d。1%、2%釋水凝膠均具有較長可持續(xù)形成有效抑菌圈時長，，為減少抗菌成分對創(chuàng)面凝膠選擇 1%PHMB 濃度最適宜。綜合比較本研究中所使用的 3 種賦予人工真皮持續(xù)抗菌能力的方法，夾人工真皮最長的可持續(xù)形成有效抑菌圈時長，其中 PHMB1%濃度與 2%濃成有效抑菌圈時長一致，故后續(xù)研究選擇將 1%PHMB 水凝膠加入人工真硅膠層間作為賦予人工真皮持續(xù)抗菌能力的方法。

圖 2-2 人真皮成纖維細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率（%），n=5。各時間段實(shí)驗樣品組合陽性對照組間均無明顯差異，P＞0.05。三、體外自然降解實(shí)驗實(shí)驗樣品主要由硅膠層、水凝膠層、膠原層三個層次組成，其中硅膠層在創(chuàng)面移植后覆蓋期間不會出現(xiàn)明顯降解，膠原層移植后于 2-3 w 降解[12][13]，本研究尚需明確水凝膠層的降解特性，故體外自然降解和體內(nèi)埋植實(shí)驗僅針對 1%PHMB 水凝膠進(jìn)行。早期水凝膠吸收水分，重量增加，但真空干燥后重量下降，大部分水凝膠在降解過程中整體結(jié)構(gòu)較完整，但有 2 塊水凝膠出現(xiàn)龜裂現(xiàn)象。體外自然環(huán)境下水凝膠降解較緩慢，6 w 時體外自然降解率為 27.388±1.943%。體外自然降解率隨時間變化見圖 2-3。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2630126