【摘要】：目的本研究探討RGD多肽修飾國產(chǎn)多孔鉭材料對MG-63細(xì)胞粘附、生長及增殖的影響,檢測細(xì)胞成骨相關(guān)因子COL-I、Integrinβ1及FAK表達(dá)水平,分析國產(chǎn)多孔鉭材料經(jīng)RGD多肽修飾后的粘附生物活性,為國產(chǎn)多孔鉭臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。方法1肉眼大體及掃描電鏡下觀察國產(chǎn)多孔鉭材料的形態(tài)特征;2 MG-63細(xì)胞培養(yǎng)并于倒置相差顯微鏡下觀察其的生長增殖狀態(tài);3 RGD多肽修飾活化多孔鉭并制備MG-63細(xì)胞-RGD多肽多孔鉭復(fù)合物。4實(shí)驗(yàn)分組:RGD多肽多孔鉭組:RGD多肽溶液修飾國產(chǎn)多孔鉭與MG-63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng);多孔鉭組:國產(chǎn)多孔鉭與MG-63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng);空白組:MG-63細(xì)胞培養(yǎng);5通過倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察檢測MG-63細(xì)胞在多孔鉭支架材料上的粘附情況;6 CCK-8法檢測各組MG-63細(xì)胞的生長增殖情況;7免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測各組MG-63細(xì)胞COLI、Integrinβ1和FAK蛋白表達(dá)情況;8 Western-blot法檢測各組MG-63細(xì)胞COL-I、Integrinβ1和FAK蛋白表達(dá)情況;9實(shí)時熒光定量PCR法檢測各組MG-63細(xì)胞COL-I、Integrinβ1和FAK m RNA表達(dá)情況。結(jié)果1鉭支架材料大體外觀為圓盤狀薄片,色灰質(zhì)硬,其表面粗糙不平,切面有光澤,鉭支架內(nèi)外均勻分布密孔,呈海綿狀,小如針尖;掃描電鏡下呈豐富均勻的微孔,內(nèi)外孔間彼此聯(lián)通呈現(xiàn)三維多孔結(jié)構(gòu),空間小梁呈微孔結(jié)構(gòu);2每日倒置相差顯微鏡下觀察MG-63細(xì)胞,接種前期大部分細(xì)胞為長梭形,少量細(xì)胞成三角形及圓點(diǎn)狀。隨著培養(yǎng)時間延長,細(xì)胞數(shù)目增加,形態(tài)趨于一致呈長梭形或多角星狀,培養(yǎng)后期細(xì)胞漿豐富形狀飽滿,彼此融合聚集呈單層細(xì)胞鋪滿瓶底,呈長梭形或多角星狀;3 CCK-8法檢測:MG-63細(xì)胞持續(xù)增殖,其OD值也隨之不斷升高。各時間點(diǎn)的RGD多肽多孔鉭組MG-63細(xì)胞增殖情況與多孔鉭組及空白組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),RGD多肽多孔鉭組細(xì)胞增殖活性顯著高于多孔鉭組和空白組;多孔鉭組與空白組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),多孔鉭組細(xì)胞增殖活性高于空白組。4掃描電鏡觀察結(jié)果示:隨共培養(yǎng)時間延長,MG-63細(xì)胞逐漸附著、粘附于多孔鉭支架材料表面上,進(jìn)而延展偽足長入多孔鉭孔隙內(nèi)部,并相互連接成片,直至細(xì)胞外基質(zhì)完全覆蓋整個多孔鉭支架。5免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果示:第5d各組MG-63細(xì)胞胞膜、漿中均不同程度表達(dá)COL-I、Integrinβ1和FAK,呈棕黃色顆粒狀。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明RGD多肽修飾多孔鉭組的Integrinβ1和FAK表達(dá)量顯著高于多孔鉭組及空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);RGD多肽多孔鉭組的COL-Ⅰ表達(dá)量高于多孔鉭組及空白組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6 Western-blot檢測結(jié)果示:RGD多肽修飾多孔鉭組MG-63細(xì)胞中COL-I、Integrinβ1的表達(dá)量顯著高于多孔鉭組及空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);RGD多肽多孔鉭組及多孔鉭組的FAK表達(dá)量略高于空白組,但差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果示:RGD多肽多孔鉭組與多孔鉭組及空白組組間相比較,COL-Ⅰ、Integrinβ1和FAK m RNA表達(dá)量均顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);多孔鉭組與空白組相比較,COL-Ⅰ、Integrinβ1和FAK m RNA表達(dá)量均顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1、國產(chǎn)多孔鉭經(jīng)RGD多肽修飾后促細(xì)胞粘附活性增加,MG-63細(xì)胞更易粘附其上;2、通過MG-63細(xì)胞膜上COL-I和Integrinβ1與多孔鉭上RGD多肽結(jié)合,將細(xì)胞信號傳導(dǎo)至細(xì)胞信號中樞FAK,激活I(lǐng)ntegrinβ1/FAK細(xì)胞信號通路,促進(jìn)細(xì)胞的粘附、生長及增殖。
【圖文】：

圖 1 大體觀察國產(chǎn)多孔鉭支架材料的形態(tài)結(jié)構(gòu)rphology of domestic porous tantalum scaffolds was g觀察多孔鉭材料形態(tài)特征描電鏡下可觀察到豐富均勻的微孔，外部小彼此聯(lián)通呈現(xiàn)三維多孔結(jié)構(gòu)；內(nèi)部整體孔隙m，孔隙空間小梁表面粗糙有光澤，內(nèi)部呈微構(gòu)相似。

多孔鉭材料在掃描電鏡下可觀察到豐富均勻的微孔，外部小孔隙直經(jīng)約為～600μm，孔間彼此聯(lián)通呈現(xiàn)三維多孔結(jié)構(gòu)；內(nèi)部整體孔隙聯(lián)絡(luò)互通，小孔約為 50～200μm，孔隙空間小梁表面粗糙有光澤，內(nèi)部呈微孔結(jié)構(gòu)（圖 2，，與人松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)相似。
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2626458