【摘要】：熒光分析法由于分析靈敏度高、選擇性好及操作較簡便等許多優(yōu)點而倍受廣大科學(xué)家的青睞,并且熒光成像擁有實時原位可視化檢測、對生物樣品損傷小、重現(xiàn)性能好等其他檢測方法所不具備的優(yōu)點。炎癥和藥物誘導(dǎo)肝損傷近年來被認(rèn)為是一個嚴(yán)重關(guān)系到公共健康的問題,因此高靈敏、高選擇的精準(zhǔn)檢測炎癥和藥物誘導(dǎo)肝損傷過程中的生物標(biāo)志物,將有助于人們更深入地了解這些疾病的發(fā)生與發(fā)展機制,對其進(jìn)行及時預(yù)防和針對性治療。過氧化亞硝酰陰離子(ONOO~-)和亮氨酸氨基肽酶(LAP)是已知的藥物誘導(dǎo)肝損傷的生物標(biāo)志物,然而由于ONOO~-的強氧化性和親核性,一些發(fā)射在可見光或近紅外光范圍內(nèi)的染料易被ONOO~-破壞,一方面會造成很多ONOO~-熒光探針選擇性欠佳,另一方面會導(dǎo)致在檢測過程中ONOO~-和LAP熒光探針出現(xiàn)假信號,最終導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。因此為解決這一問題,本文致力于提高熒光探針的選擇性、靈敏度和準(zhǔn)確性,通過合理設(shè)計和染料篩選策略相結(jié)合構(gòu)建了一系列雙光子或近紅外熒光探針�；谙愣顾�、萘酰亞胺、羅丹明和長沙染料為熒光信號團,分別設(shè)計合成了ONOO~-和LAP熒光探針。具體內(nèi)容如下:第一,通過合理設(shè)計和染料篩選策略相結(jié)合,我們發(fā)展了一個雙光子比率熒光探針MITO-CC,用于選擇性檢測體外和生物環(huán)境中的ONOO~-�；贔RET機理的比率探針MITO-CC不僅表現(xiàn)出高靈敏度(11.30 nM)、對ONOO~-的快速響應(yīng)(20 s內(nèi)),而且在生理pH水溶液中能避免其它各種生物活性氧和活性氮的干擾而高選擇性的檢測ONOO~-。探針MITO-CC不僅具有較小的細(xì)胞毒性,且被成功應(yīng)用于比率檢測細(xì)胞和組織中內(nèi)源性O(shè)NOO~-。此外,探針MITO-CC也可檢測小鼠炎癥模型中LPS刺激產(chǎn)生的ONOO~-。該探針對于揭示在各種生理和病理條件下ONOO~-的作用方面具有很好的應(yīng)用前景。第二,為了發(fā)展普適性熒光探針,基于ONOO~-介導(dǎo)的α-酮酰胺的脫保護(hù)反應(yīng)機制,我們進(jìn)一步設(shè)計合成了兩個ONOO~-熒光探針Naph-ONOO~-和Rhod-ONOO~-。這些探針不僅可以不受其他生物物種的干擾高特異性的檢測體外ONOO~-,而且能夠原位成像和實時監(jiān)控生物體內(nèi)ONOO~-的生成。其中,基于萘酰胺熒光團的雙光子熒光探針Naph-ONOO~-可實現(xiàn)單/雙光子成像。另一個主要累積在線粒體中的探針Rhod-ONOO~-表明藥物誘導(dǎo)氧化應(yīng)激過程中ONOO~-主要產(chǎn)生在線粒體。另外,我們首次通過CYP450家族氧化酶介導(dǎo)的外源物代謝過程追蹤到了ONOO~-的生成,深入探索了藥物性肝毒性修復(fù)的途徑。第三,為了更深入探索藥物誘導(dǎo)肝損傷過程,我們結(jié)合近紅外熒光染料篩選和合理設(shè)計策略,構(gòu)建了小分子近紅外熒光探針NIR-ONOO~-和NIR-LAP,它們能夠高選擇、高靈敏地檢測生理條件和生物體系中ONOO~-和LAP的變化水平。另外,利用近紅外探針獨特的光學(xué)特性,通過近紅外熒光成像,NIR-ONOO~-和NIR-LAP也準(zhǔn)確檢測了APAP誘導(dǎo)的活細(xì)胞和小鼠肝毒性過程中ONOO~-和LAP兩種生物標(biāo)志物的微小波動,并評價了幾種保肝藥物對肝損傷小鼠的治療效果。這兩種近紅外熒光探針的開發(fā),為研究ONOO~-/LAP與藥物誘導(dǎo)肝損傷之間的復(fù)雜關(guān)系提供了有效工具,有助于藥物誘導(dǎo)肝損傷的診斷和治療藥物的開發(fā)。第四,本章中我們設(shè)計合成了一個基于反應(yīng)型的雙光子線粒體靶向熒光探針,MitoTP-ONOO~-。此探針能夠分別在生理條件下和細(xì)胞中高選擇、高靈敏地檢測ONOO~-水平。結(jié)合以上工作發(fā)展的探針NIR-LAP,基于探針MitoTP-ONOO~-和NIR-LAP所具有的優(yōu)良的雙光子和近紅外性質(zhì),我們擬利用這些探針實時檢測APAP誘導(dǎo)肝損傷過程中ONOO~-和LAP的產(chǎn)生,深入揭示此過程中ONOO~-和LAP的不同變化,有望為藥物誘導(dǎo)肝損傷的預(yù)防及治療提供新思路。
【圖文】：

雙光子吸收截面以下公式進(jìn)行計算（1δs=δr(FsΦrnrCr)/(FrΦsn “r” 代表標(biāo)準(zhǔn)已知物。的濃度, n 表示物質(zhì)在溶Φ 代表物質(zhì)的熒光量子光發(fā)射強度和發(fā)射波長，其激發(fā)和發(fā)射波長都 205 nm 和 278 nm, 而長已紅移到 356 nm 和

圖 1.2 化合物 1-3 的熒光性質(zhì)另外，熒光物質(zhì)的剛性平面結(jié)構(gòu)也是影響分子熒光性質(zhì)的重要原因。當(dāng)熒光分子的共軛程度一樣時，分子的剛性平面性越大，其熒光強度和產(chǎn)率就越高，這主要是由于具有剛性平面的分子會抑制激發(fā)態(tài)分子內(nèi)旋非輻射躍遷，進(jìn)而導(dǎo)致熒光增強。如下圖 1.3 所示，酚酞由于差的剛性因此本身沒有熒光，而僅比酚酞多個氧橋鍵的熒光素就展現(xiàn)出了強熒光于氧橋鍵的加入增加了兩個苯環(huán)的剛性共平面性，進(jìn)而熒光效率增強。圖 1.3 酚酞和熒光素的結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：O657.3;R318

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本文編號：2625239