【摘要】：研究背景及目的中國(guó)是終末期肝病(End stage liver disease,ESLD)的高發(fā)地區(qū),肝移植是治療終末期肝病最重要的有效手段,但由于供體不足,大量肝衰竭患者無法得到及時(shí)救治。隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展,工程化肝臟技術(shù)為終末期肝病的治療帶來了新的希望。雖然目前研究眾多,但是種子細(xì)胞的來源、三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建、血管網(wǎng)絡(luò)和膽管結(jié)構(gòu)的重建等一系列技術(shù)問題仍未得到很好的解決,制約著肝臟組織工程的發(fā)展。至今為止,尚未有任何一款組織工程肝臟可在真正意義上走向臨床。肝臟組織工程最佳的種子細(xì)胞選擇當(dāng)屬人的原代肝細(xì)胞。但是,原代肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)會(huì)逐漸失去其形態(tài)學(xué)特征和肝細(xì)胞特異功能,且它的體外擴(kuò)增一直是肝再生領(lǐng)域尚未解決的瓶頸問題,此外還必須考慮倫理限制和細(xì)胞來源匱乏的問題。現(xiàn)有的解決方法主要包括:使用永生化肝細(xì)胞株替代原代肝細(xì)胞;將各類干細(xì)胞在體外定向分化為功能性肝細(xì)胞;通過采用導(dǎo)入外源基因的方法使體細(xì)胞去分化為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞再進(jìn)行肝向分化;將體細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞)直接基因重編程為誘導(dǎo)肝細(xì)胞。此外,近期我們研究團(tuán)隊(duì)和日本科學(xué)家?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn),通過小分子重編程技術(shù),可以將小鼠的原代肝細(xì)胞去分化形成肝臟前體樣細(xì)胞,該細(xì)胞可在體外進(jìn)行規(guī)�；瘮U(kuò)增,且分化后可重新獲得成熟肝細(xì)胞的功能。這些類肝細(xì)胞在體外雖然具有一定的肝功能,但是它們各自存在著成熟度不足、有限性擴(kuò)增、功能不穩(wěn)定、異種移植排斥、生物安全性不高和致瘤風(fēng)險(xiǎn)等應(yīng)用障礙。肝芽是具有發(fā)育能力和肝功能的初期肝臟組織,是肝臟發(fā)育的起源。最近,Takebe團(tuán)隊(duì)將人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的肝臟前體細(xì)胞(iPSC-HEs)與人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)、人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBM-MSCs)在體外進(jìn)行混合培養(yǎng),建立了一種培育肝芽的方法。將這些肝芽移植入小鼠體內(nèi)后,會(huì)快速地生成血管結(jié)構(gòu)并與小鼠本身的血管連接,還可以表現(xiàn)出部分人類肝臟所特有的功能。然而這些肝芽的規(guī)模太小了,不能形成膽管結(jié)構(gòu),無法在體外進(jìn)行功能分化和長(zhǎng)期維持,移植后也未能在體內(nèi)發(fā)育成完整的肝臟功能模塊,所以在將這種方法引入臨床前還需要進(jìn)行相當(dāng)大量的研究及優(yōu)化。結(jié)合上述問題,本研究通過實(shí)現(xiàn)人原代肝細(xì)胞的體外擴(kuò)增,以及基于肝芽的形成構(gòu)建了具有生理功能和三維立體形態(tài)的工程化肝臟。我們?yōu)楦闻K組織工程提供了全新的種子細(xì)胞來源,并為肝臟組織工程的構(gòu)建開辟了新思路及新策略,對(duì)人類重要器官的再生和重建具有重要的科學(xué)意義。研究方法1.通過兩步灌流法分離獲取人的原代肝細(xì)胞,用改良的肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖培養(yǎng)基(TEM)進(jìn)行擴(kuò)增,并對(duì)增殖的肝細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證;2.將HepLPCs、HUVECs和hUC-MSCs按比例在體外混合培養(yǎng),對(duì)形成的肝芽進(jìn)行觀察,并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化;3.采用ELISA、CCK8、生化檢測(cè)以及PCR等檢測(cè)手段確定體外培養(yǎng)的肝芽的細(xì)胞活力、肝細(xì)胞功能、以及是否具有肝膽雙向分化的潛能;4.通過低溫化學(xué)方法制備肝臟脫細(xì)胞生物支架,并對(duì)其進(jìn)行去細(xì)胞效果、生物成分、形態(tài)結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞學(xué)毒性的檢驗(yàn);5.將上述三種細(xì)胞按比例混合后輸入肝臟脫細(xì)胞生物支架內(nèi),構(gòu)建工程化肝臟,并在體外用搭好的循環(huán)灌注培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng);6.對(duì)在體外構(gòu)建的工程化肝臟在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行肝功能評(píng)價(jià)和組織學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果1.發(fā)現(xiàn)在特定的培養(yǎng)條件刺激下,人的原代肝細(xì)胞可以在體外轉(zhuǎn)化為HepLPCs來進(jìn)行規(guī)�；瘮U(kuò)增;2.來自于不同供體的、不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的、不同代數(shù)的HepLPCs具有肝前體細(xì)胞的特征,且在長(zhǎng)期的培養(yǎng)過程中能夠保持穩(wěn)定,具有高度的相似性;3.建立HepLPCs、HUVECs和hUC-MSCs三種細(xì)胞共培養(yǎng)體系,發(fā)現(xiàn)它們?cè)隗w外混合培養(yǎng)后可以形成肝芽;4.肝芽在體外維持培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的損傷和凋亡情況不明顯,肝功能沒有穩(wěn)定上升,但膽系轉(zhuǎn)錄因子有所提高,發(fā)現(xiàn)肝芽存在向膽管分化的潛能;5.制備有效去除細(xì)胞成分、形態(tài)結(jié)構(gòu)以及基質(zhì)成分保存良好的肝臟脫細(xì)胞生物支架;6.基于肝芽的形成,將上述三種細(xì)胞按比例混合后輸入肝臟脫細(xì)胞生物支架內(nèi),在體外構(gòu)建具有生理功能和三維立體結(jié)構(gòu)的工程化肝臟,并進(jìn)行維持培養(yǎng)。12天后,觀察到類膽管結(jié)構(gòu)。結(jié)論本研究通過對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行改良和優(yōu)化,用小分子重編程技術(shù)使得人的原代肝細(xì)胞在體外可以去分化為HepLPCs來進(jìn)行增殖,為肝臟組織工程提供了全新的種子細(xì)胞來源。隨后我們發(fā)現(xiàn)HepLPCs可以與HUVECs和hUC-MSCs在體外混合培養(yǎng)形成肝芽�；谶@種肝芽的形成,我們將三種細(xì)胞按比例混合后輸入肝臟脫細(xì)胞生物支架內(nèi),經(jīng)過灌注培養(yǎng)構(gòu)建了具有三維立體結(jié)構(gòu)和生理功能的工程化肝臟。我們的研究能夠?yàn)楦闻K組織工程的構(gòu)建提供新的思路,對(duì)人類重要器官再生和重建具有重要的科學(xué)意義。
【圖文】：

以及較高的細(xì)胞核漿比（圖1E)。我們將在 TEM 中培養(yǎng)的、處于增殖狀態(tài)的肝細(xì)胞命名為 HepLPCs。通過q-PCR 實(shí)驗(yàn)，我們將胎肝細(xì)胞以及不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的 HepLPCs 進(jìn)行 mRNA 表達(dá)水平的比較，結(jié)果顯示在 TEM 培養(yǎng)條件下，多種肝細(xì)胞標(biāo)志物（ALB、G6PC、HNF4A）的表達(dá)水平下降，而多種肝前體細(xì)胞標(biāo)記物（CK19、CK7、SOX9）的表達(dá)水平則逐漸上升（圖 1F）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們，在改良的 TEM 培養(yǎng)基中，人的原代肝細(xì)胞可以在體外轉(zhuǎn)化為肝前體樣細(xì)胞（HepLPCs）來進(jìn)行增殖。

在原代肝細(xì)胞向肝前體樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中，與肝功能相關(guān)的信號(hào)通路出現(xiàn)降低的趨勢(shì)（圖2B 上）；而與肝前體細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)通路則呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)（圖 2B 下）。通過 q-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，HepLPCs 不僅表達(dá)了肝細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志基因，，如 ALB、HNF1A、 HNF4A 和 CK18；還同時(shí)高表達(dá)了肝前體細(xì)胞的標(biāo)志基因，如 SOX9、CK19、CD24、EpCAM 和 AFP，這說明增殖的 HepLPCs 在轉(zhuǎn)錄水平具有肝前體細(xì)胞的特征（圖 2C）。隨后，我們用流式抗體檢測(cè)分析了在 HepLPCs 中 ALB、CK18、HNF1A、CK19、SOX9、HNF4A、CD24 以及 EpCAM 陽性細(xì)胞的比例，其結(jié)果再次印證了上述 q-PCR 的分析結(jié)論（圖 2D）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們，與原代肝細(xì)胞相比，來自于不同供體的、不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的、不同代數(shù)的 HepLPCs 都更加接近于胎肝細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R318.14

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2621727