發(fā)布時(shí)間：2020-04-08 09:12

【摘要】：目的:利用慢病毒轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells iPSCs)分化得到的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells MSCs)作為種子細(xì)胞在體外聯(lián)合微孔化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(micropore acellular dermal matrix MADM)構(gòu)建人工復(fù)合皮,移植于SD大鼠全層損傷皮膚模型創(chuàng)面,觀察和分析此種復(fù)合皮的創(chuàng)面修復(fù)能力,以驗(yàn)證新型種子細(xì)胞iPSCs源性MSC在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的效果。方法:1、復(fù)蘇人成纖維細(xì)胞來(lái)源的iPSC-MSCs,傳代培養(yǎng)記錄細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,并通過(guò)成脂誘導(dǎo)分化和成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單驗(yàn)證細(xì)胞的多能性。分離大鼠背部皮膚經(jīng)酶消化法聯(lián)合去污劑法制備ADM,激光打孔后獲得MADM。將種子細(xì)胞MSCs接種于ADM制備人工復(fù)合皮,通過(guò)DAPI染液染色標(biāo)記細(xì)胞,鏡下計(jì)數(shù)并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,酶標(biāo)儀檢測(cè)450mm波長(zhǎng)處OD值判斷ADM的細(xì)胞毒性。2、取12只SD大鼠實(shí)驗(yàn)前喂養(yǎng)數(shù)天,常規(guī)腹腔麻醉,于背部正中部位做U形皮瓣切口,皮瓣邊長(zhǎng)2厘米,完整去除全層皮膚,分離皮下筋膜,灼熱鐵絲止血并燙傷創(chuàng)周表皮。將12只SD大鼠隨機(jī)分成2組:A組MSCs+MADM復(fù)合皮組、B組單純MADM組。將MSCs+MADM復(fù)合皮、單純MADM分別移植于對(duì)應(yīng)組創(chuàng)面上,凡士林油紗覆蓋,打包法縫合固定后分籠飼養(yǎng)。分別于植入后第1周、第2周、第3周和第4周肉眼觀察創(chuàng)面外觀及移植皮片周緣的組織生長(zhǎng)狀況,并經(jīng)過(guò)組織學(xué)HE染色鑒定鏡下組織生長(zhǎng)。熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組復(fù)合皮細(xì)胞的存活情況。記錄各組各只大鼠創(chuàng)面完全恢復(fù)時(shí)間,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析:實(shí)驗(yàn)納入SD大鼠12只,分為2組,進(jìn)行結(jié)果分析的大鼠12只,實(shí)驗(yàn)中無(wú)脫失。2、iPSC-MSCs的體外培養(yǎng)及傳代:復(fù)蘇第8代細(xì)胞接種后呈圓形,24小時(shí)后大部分細(xì)胞貼壁,貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)梭型及類(lèi)圓形,6-8天后細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭型,成纖維細(xì)胞樣、漩渦狀生長(zhǎng)。培養(yǎng)周期為10-12天。成脂分化誘導(dǎo)并經(jīng)油紅O染色后可見(jiàn)大而圓的脂滴,成骨誘導(dǎo)分化并經(jīng)茜素紅染色可見(jiàn)鈣沉淀。表明iPSC-MSC與其他類(lèi)型MSCs具有十分相似的生長(zhǎng)特點(diǎn),細(xì)胞活性和多能性良好,分化潛能巨大。酶標(biāo)儀OD值檢測(cè)顯示聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞與單純培養(yǎng)細(xì)胞差異不明顯,說(shuō)明制備的MADM性能良好,無(wú)細(xì)胞毒性,可用于復(fù)合皮制備及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。3、創(chuàng)面大體觀察:A組人工復(fù)合皮移植組平均愈合時(shí)間為17.33天,鏡下見(jiàn)人工復(fù)合皮周?chē)罅啃律W(wǎng)狀血管包繞,顏色紅潤(rùn),觸之質(zhì)地較柔軟,與皮下組織融合緊密,邊界模糊。B組單純MADM移植組創(chuàng)面平均愈合時(shí)間為21.83天,移植皮片周?chē)律茌^多,但明顯少于實(shí)驗(yàn)組A組,且皮片與皮下組織融合狀況一般,邊界較清楚。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組愈合時(shí)間,差異有顯著性意義(P0.05)。表明新型種子細(xì)胞制備的人工復(fù)合皮能夠更好地促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。4、組織學(xué)HE染色檢查及熒光顯微鏡下觀察:移植初期,實(shí)驗(yàn)組A組與對(duì)照組B組移植皮片周?chē)霈F(xiàn)輕度炎癥反應(yīng)表現(xiàn),HE染色示炎性細(xì)胞浸潤(rùn),兩組相差不大。移植后第2周觀察顯示:實(shí)驗(yàn)組A組血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯多于對(duì)照組B組,A組皮下有乳頭狀結(jié)構(gòu)突入復(fù)合皮內(nèi),與復(fù)合皮融合交錯(cuò),且出現(xiàn)少許脂肪樣組織;對(duì)照組B組周?chē)泊嬖谏僭S環(huán)形新生血管結(jié)構(gòu),皮片與皮下組織分界明顯。熒光顯微鏡下可見(jiàn)移植第一周鏡下藍(lán)色熒光點(diǎn)較多,隨著時(shí)間推移熒光逐漸暗淡,熒光點(diǎn)減少至消失,考慮細(xì)胞正常的代謝凋亡所致。結(jié)論:新型種子細(xì)胞iPSC-MSCs培養(yǎng)條件與常見(jiàn)MSCs相似,具有較高的分化潛能。人工制備MADM細(xì)胞毒性不明顯,是較好的復(fù)合皮支架材料的選擇。利用新型種子細(xì)胞iPSC-MSCs細(xì)胞聯(lián)合MADM制備人工復(fù)合皮能夠較好的加快創(chuàng)面修復(fù)進(jìn)程,增加缺損組織填充,有希望成為一種廣泛應(yīng)用的種子細(xì)胞。
【圖文】：

MADMHE染色×100附

MADMHE染色×200
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R318.1

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本文編號(hào)：2619166