【摘要】：研究目的骨科臨床工作中,骨骼的創(chuàng)傷、腫瘤、畸形、退變等疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療過程中產(chǎn)生的骨缺損一直是外科醫(yī)生相對棘手的難題之一。骨缺損的治療離不開骨組織重建,而進(jìn)行骨缺損的組織結(jié)構(gòu)重建時(shí),需要合適的填充材料來代替原來缺失的骨質(zhì)。臨床中所使用的自體骨、同種異體骨或是其他填充材料都存在或多或少的缺陷。隨著骨組織工程和3D打印技術(shù)的相繼出現(xiàn),骨移植替代物的研制又邁出了新的方向。理想的骨移植替代物應(yīng)當(dāng)具備成骨性、骨誘導(dǎo)性、骨傳導(dǎo)性和骨整合性四種特性。聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone,PCL)和磷酸三鈣(Tricalcium phosphate,TCP)均為具有生物相容性和生物可降解性的材料,作為復(fù)合材料具有良好的傳導(dǎo)成骨、誘導(dǎo)成骨特性以及一定的機(jī)械強(qiáng)度,針對于這兩者的復(fù)合材料研究也是當(dāng)前熱點(diǎn)之一。表面形貌的改變,直接影響依附于支架生長的細(xì)胞的增殖分化行為,表面粗糙的多孔支架對于細(xì)胞成骨分化具有促進(jìn)作用。脫鈣骨基質(zhì)(Demineralized bone matrix,DBM)作為一種同種異體骨移植替代物,除了含有93%的膠原外,還包含5%的絕大部分成骨誘導(dǎo)因子。通過涂層的方法將DBM依附于骨組織工程支架上,同時(shí)將DBM納米化以最小化其對原有支架形態(tài)的影響或許是一種可行的增強(qiáng)成骨效果的涂層修飾方法。本研究以3D打印技術(shù)作為制備方法,嘗試對PCL和TCP復(fù)合支架進(jìn)行粗糙化改性,并涂層以納米化DBM,通過一系列物理性能表征、體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對新型支架的骨缺損修復(fù)能力進(jìn)行初步探索。研究方法首先通過3D打印技術(shù)中的熔融沉積成型技術(shù)制備PCL-TCP復(fù)合支架,并通過有機(jī)溶劑蝕刻的方法完成支架纖維的粗糙化改性,制備表面多孔PCL-TCP復(fù)合支架,對其微觀形貌、孔隙率、力學(xué)特性等進(jìn)行檢測;在此基礎(chǔ)上,通過真空凍干法將納米化的DBM負(fù)載于表面多孔PCL-TCP復(fù)合支架的纖維表面完成涂層修飾。隨后,將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)接種于表面多孔PCL-TCP復(fù)合支架及其負(fù)載納米DBM涂層修飾的支架,并以未經(jīng)任何修飾的PCL-TCP復(fù)合支架作為對照,通過CCK-8、ALP活性、鈣離子定量、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot等檢測手段,評價(jià)BMSC在不同復(fù)合支架上的粘附、增殖和成骨分化效果。最后,構(gòu)建新西蘭兔橈骨中段臨界骨缺損模型,將表面多孔nanoDBM-PCL-TCP復(fù)合支架和表面多孔PCL-TCP復(fù)合支架作為填充材料,同時(shí)使用磷酸鈣人工骨作為對照,通過術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的影像學(xué)和組織學(xué)檢測,對新型支架的體內(nèi)骨缺損修復(fù)能力進(jìn)行初步研究。研究結(jié)果通過熔融沉積成型技術(shù)構(gòu)建的PCL-TCP復(fù)合支架存在預(yù)先設(shè)置的多孔結(jié)構(gòu),孔隙之間相互聯(lián)通;經(jīng)過有機(jī)溶液蝕刻形成表面多孔,兼有宏觀和微觀孔隙,表面粗糙度和孔隙率增大。支架原有孔隙仍保持在500μm左右,新形成的較大的孔洞約50-300μm,較小的孔洞小于10μm;表面多孔PCL-TCP復(fù)合支架的力學(xué)強(qiáng)度接近人體松質(zhì)骨的力學(xué)強(qiáng)度;負(fù)載納米DBM涂層修飾后仍能存在原有的多孔結(jié)構(gòu),孔徑在50-200μm不等,同時(shí)纖維表面涂布有大量形態(tài)不規(guī)則、大小不等的納米DBM團(tuán)塊,最小粒徑在200-300nm。體外細(xì)胞學(xué)檢測中,相比于PCL-TCP復(fù)合支架和表面多孔PCL-TCP復(fù)合支架,表面多孔nanoDBM-PCL-TCP復(fù)合支架在BMSC的粘附增殖和成骨分化上更具優(yōu)勢,具有更好的骨誘導(dǎo)性。最后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,表面多孔nanoDBM-PCL-TCP復(fù)合支架在體內(nèi)成骨效果優(yōu)于表面多孔PCL-TCP復(fù)合支架,植入后前者的骨體積分?jǐn)?shù)和骨礦物密度明顯高于后者;與商業(yè)化的β-TCP人工骨相比,早期成骨納米DBM涂層支架效果稍好,但最終12周時(shí)的成骨結(jié)果兩種支架基本一致。該結(jié)果表明表面多孔nanoDBM-PCL-TCP復(fù)合支架具有良好的成骨特性,能夠有效促進(jìn)新骨生成。研究結(jié)論本研究所制備的表面多孔nanoDBM-PCL-TCP復(fù)合支架具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)和近似松質(zhì)骨的力學(xué)特性,它可以促進(jìn)BMSC的粘附增殖和成骨分化,同時(shí)能夠促進(jìn)臨界骨缺損的修復(fù)。該支架具有良好的體內(nèi)外成骨能力,有望成為一種具有發(fā)展前景的骨移植替代物。
【圖文】：

電機(jī)助推微注射器（MotorAssisted Microsyringe，MAM）快速成型系統(tǒng)（備 PCL-TCP 復(fù)合支架。該技術(shù)屬于 FDM 技術(shù)，可以直接導(dǎo)入 STL 格式用 MAM 配套軟件設(shè)計(jì)打印模型。支架打印模型一：為新西蘭兔脛腓骨 CT 三維重建模型部分區(qū)域（圖 試支架的個(gè)體化制備，，設(shè)計(jì)纖維直徑 0.3mm，層高 0.25mm，疊加角度°，擠出噴頭移動(dòng)速度 5mm/s；支架打印模型二：為長寬高均為 1cm 的正方體，進(jìn)行體外物理性能表直徑 0.5mm，層高 0.3mm，疊加角度為 0/90°，擠出噴頭移動(dòng)速度 5mmPCL 和納米 β-TCP 顆粒按照質(zhì)量配比 10:0、9:1、8:2、7:3 的比例分別預(yù)過轉(zhuǎn)矩流變儀均勻混合，經(jīng)切粒機(jī)制備 3D 打印所使用的不同混合比例材料。將預(yù)先制備的顆粒狀混合材料置入料筒，設(shè)定熔融池進(jìn)料溫度 12 110℃，混合材料在熔融池內(nèi)保溫 120 分鐘以上，確保充分熔融。融化過電機(jī)助推微注射器式精細(xì)噴頭擠出，纖維層層疊加形成支架。待支架其置入體積分?jǐn)?shù) 70%乙醇中 24 小時(shí)，風(fēng)干后密封保存?zhèn)溆谩?

表面多孔 PCL-TCP 復(fù)合支架的構(gòu)建及其負(fù)載納米 DBM 涂層修飾作為骨移植替代物的實(shí)驗(yàn)研究二、結(jié)果（一）表面多孔 PCL-TCP 復(fù)合支架的制備1、表面多孔 PCL-TCP 復(fù)合支架的構(gòu)建通過 3D 打印機(jī)成功構(gòu)建 PCL-TCP 復(fù)合支架，支架整體結(jié)構(gòu)可控，可根據(jù) CAD軟件自行設(shè)計(jì)，也可根據(jù)影像學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行個(gè)性化制備（圖 1-2）。將 10∶0、9∶1、8∶2、7∶3 質(zhì)量比例混合各組的支架分別命名為 PCL、PCL-10%TCP、PCL-20%TCP、PCL-30% TCP。其中，PCL-30%TCP 制備過程中噴頭極易堵塞，無法完成支架構(gòu)建。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R318.08;R68

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本文編號：2604964