【摘要】：目的:1.檢驗h ADSC-EV是否能夠促進(jìn)成骨分化;2.探索將MSC-EV用于Ti材料表面改性的可行性;3.研發(fā)一種適用于金屬植入物表面錨定MSC-EV的方式;4.檢驗經(jīng)h ADSC-EV表面活化改性的Ti材料是否具備更好的促進(jìn)骨再生能力,為臨床醫(yī)用金屬植入物的表面改性提供新的思路。方法:1.采用超速離心法制備h ADSC-EV,并通過SEM、顆粒跟蹤分析、Western-blot等方式對其進(jìn)行鑒定;以人成骨樣細(xì)胞MG63為對象,通過茜素紅染色與鈣定量檢測等方式檢驗h ASC-EV是否具備促進(jìn)成骨分化的作用;通過基因芯片以及生物信息學(xué)分析等手段對h ASC-EV中可能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行初步篩選。2.應(yīng)用恒電位法制備Bio-Ppy-Ti(生物素-聚吡咯-鈦),設(shè)置實驗分組:Ti、Ppy-Ti、Bio-Ppy-Ti,通過SEM、AFM、熒光顯像等手段對各組材料的表面形貌、粗糙度以及生物素負(fù)載量進(jìn)行表征;將生物素修飾的h ADSC-EV孵育到Bio-Ppy-Ti表面,通過共聚焦觀察比較第0天、第7天與第14天材料表面的EV殘留量,檢測錨定的長效性;將生物素修飾的h ADSC-EV分別孵育到各組材料表面后進(jìn)行超聲震蕩處理,通過SEM以及共聚焦顯微鏡觀察各材料表面EV的殘留量,檢測錨定的穩(wěn)定性。3.設(shè)置實驗分組:Ti、Bio-Ppy-Ti、EV-Bio-Ppy-Ti,在不同材料表面接種人成骨樣細(xì)胞MG63,通過F-actin染色比較早期不同時間點(6h、12h、24h)的細(xì)胞形態(tài)以及黏附情況;培養(yǎng)14天后,通過q RT-PCR與免疫熒光觀察細(xì)胞在不同材料表面培養(yǎng)后成骨相關(guān)基因(ALP、COL1、OCN)與蛋白(COL1、OCN)的表達(dá);在不同材料表面接種人成骨樣細(xì)胞MG63并培養(yǎng)14天,隨后埋植裸鼠(Balb/c,雌性,8-9周齡)皮下,一個月后對局部組織進(jìn)行HE及免疫組化分析。結(jié)果:1.添加10μg/m L h ADSC-EV培養(yǎng)MG63細(xì)胞14天后,細(xì)胞內(nèi)外總鈣含量為1.1855±0.1860 mmol/L,而空白對照組為0.1418±0.0120 mmol/L,陰性對照組(h DFEV)為0.1729±0.0370 mmol/L,其中h ADSC-EV組的鈣含量相對于空白對照組與陰性對照組顯著提高。進(jìn)一步在表達(dá)量前30位的h ADSC-EV mi RNA中篩選到5種可以調(diào)控成骨分化的mi RNA。2.通過電化學(xué)聚合法可成功在Ti表面聚合Bio-Ppy涂層,電化學(xué)聚合條件為1.5V、120s時,Bio-Ppy-Ti表面的生物素?fù)诫s量最多;生物素化的h ADSC-EV在Bio-Ppy-Ti表面孵育7天與14天后,EV的殘留量分別為初始狀態(tài)的96.17%與94.67%;生物素化的h ADSC-EV孵育到各組材料進(jìn)行超聲震蕩處理30s后,Ti、Ppy-Ti與Bio-Ppy-Ti表面的EV殘留量分別為初始狀態(tài)的0.34%、0.67%與62.74%,其中Bio-Ppy-Ti組顯著高于Ti組與Ppy-Ti組。3.在不同材料表面接種MG63細(xì)胞培養(yǎng)6小時后,Ti、Bio-Ppy-Ti與EV-Bio-Ppy-Ti表面的細(xì)胞投影面積分別是946.42±69.32μm2、841.69±147.98μm2與1361.26±163.14μm2,其中Bio-Ppy-Ti組顯著高于Ti組與Ppy-Ti組;在不同材料表面接種MG63細(xì)胞培養(yǎng)14天后,EV-Bio-Ppy-Ti組中細(xì)胞的ALP基因、COL1基因與OCN基因的表達(dá)量分別為Ti組的1.27倍、1.68倍與1.82倍,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;不同材料經(jīng)裸鼠皮下植入一個月后,EV-Bio-Ppy-Ti組的皮下組織中可見少量散在分布的OCN陽性細(xì)胞,而Ti組與Bio-Ppy-Ti組的皮下組織內(nèi)未見OCN陽性表達(dá)的細(xì)胞。結(jié)論:1.h ADSC-EV可以在體外促進(jìn)成骨樣細(xì)胞MG63的成骨分化;h ADSC-EV中富含多種可以調(diào)控成骨分化的mi RNA。2.通過恒電位法可在Ti表面制備出Bio-Ppy涂層,在1.5V、120s聚合條件下生物素的摻雜含量最多;h ADSC-EV能通過ABC法在Bio-Ppy-Ti表面長期負(fù)載達(dá)14天;h ADSCEV能通過ABC法在Bio-Ppy-Ti表面穩(wěn)定負(fù)載,至超聲震蕩300s后才全部脫落。3.經(jīng)h ADSC-EV修飾的Ti材料能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的早期黏附與伸展;同時,經(jīng)h ADSC-EV修飾的Ti材料能夠在體內(nèi)與體外促進(jìn)成骨細(xì)胞中成骨相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)。
【圖文】：

選統(tǒng)計學(xué)顯著性。5）miRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)由 WGCNA 構(gòu)建，miRNA 和 mRNA 之間的相關(guān)篩選閾值為大于 0.8。2.5 統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩個組間的均值比較使用 Student’s-t 檢驗，多組間的均值比較使用單因素方差分析（One Way ANOVA）以及 Newman-Keuls 檢驗以 p< 0.05 表示數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)差異。所有數(shù)據(jù)均使用 GraphPad Prism5 軟件進(jìn)行統(tǒng)學(xué)分析。3. 實驗結(jié)果3.1 hADSC 的觀察與鑒定

研究所提取的 hADSC 陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物 CD90 與 CD105，以及細(xì)胞粘分子 CD29、CD44，同時陰性表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志物 CD45。3.2 hADSC-EV 的觀察與鑒定通過掃描電鏡與透射電鏡對 hADSC-EV 的形態(tài)進(jìn)行觀察，在掃描電鏡下可hADSC-EV 呈較為均一的球形顆粒（圖 2.A），直徑均在 1μm 以下；透射電鏡下可察到由脂質(zhì)雙分子層形成的茶托樣結(jié)構(gòu)（圖 2.B）。同時，hADSC-EV 可被脂質(zhì)特異燃料 PKH26 染色（圖 C）。以上結(jié)果說明，所提取的 hADSC-EV 是具有納米級別的形脂質(zhì)顆粒。通過蛋白免疫印跡法在 hADSC-EV 內(nèi)檢測到了其特異性的跨膜蛋白族 CD9 與 CD81 的表達(dá)（圖 2.D）。由于僅通過電鏡下的形態(tài)觀察還不足以對 hADSEV 的粒徑進(jìn)行精確分析，因此，我們采用納米顆粒跟蹤分析儀對 hADSC-EV 進(jìn)行相應(yīng)的分析，發(fā)現(xiàn)其直徑范圍在 100nm-800nm，主要集中于 174nm（圖 2.E）。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R318.08

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本文編號：2602599