發(fā)布時間：2020-03-21 06:45

【摘要】：目的:1.評估聚己內(nèi)酯(PCL)、聚二惡烷酮(PDS)熔融紡絲制備仿生可降解椎間盤纖維環(huán)支架的可行性。2.研究可降解支架復(fù)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HWJ-MSCs)構(gòu)建仿生可降解組織工程纖維環(huán)的可行性。方法:1.以PCL、PDS及兩者不同比例混合物為原料,通過熔融紡絲技術(shù)制備五組不同比例的仿生支架,包括PCL組、PCL/PDS70/30組、PCL/PDS50/50組、PCL/PDS30/70組和PDS組。通過體式顯微鏡和掃描電子顯微鏡(SEM)觀察支架的宏觀和微觀結(jié)構(gòu);分別測量支架纖維直徑、孔徑、孔隙率;使用力學(xué)儀器測量支架的力學(xué)性能;通過接觸角測量儀測量其親水性;通過體外模擬和皮下埋植觀察支架體外降解及體內(nèi)降解情況;通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(ELASA)檢測降解組織周圍炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)情況。2.提取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HWJ-MSCs),將原代HWJ-MSCs培養(yǎng)并傳代擴(kuò)增至P3代,將P3代HWJ-MSCs接種到熔融紡絲纖維環(huán)支架上,通過CCK-8檢測細(xì)胞在支架上的黏附、增殖情況;Live/Dead染色檢測細(xì)胞在支架上的存活情況;通過SEM觀察細(xì)胞在支架上的黏附、伸展和細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況;通過異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞在支架上的細(xì)胞骨架形態(tài)。將P3代細(xì)胞接種在仿生支架上,加入類纖維環(huán)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)HWJ-MSCs向類纖維環(huán)細(xì)胞分化,通過Western-blot檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)1周和3周后細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白及Aggrecan蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1.支架宏觀結(jié)構(gòu)規(guī)則,呈中空圓柱體,支架外徑為6 mm,內(nèi)徑為2 mm,外觀顏色為乳白色。體視顯微鏡下可見纖維呈環(huán)形圓周取向分布,纖維間有菱形孔隙;SEM觀察顯示各組支架纖維直徑粗細(xì)均勻,直徑均為45-55μm,孔徑大小均勻,約為70-75μm,纖維呈斜交疊層結(jié)構(gòu),成角約為60°;力學(xué)性能檢測結(jié)果表明純PDS組支架的力學(xué)性能最差,其拉伸模量為1.20±0.27 MPa,壓縮模量0.07±0.01 MPa,PCL組的力學(xué)性能最好,其拉伸模量為8.43±0.44 MPa,壓縮模量為1.88±0.08 MPa,三組混合支架的力學(xué)性能則隨著PCL比例的增加逐漸變強(qiáng);親水性檢測結(jié)果表明PDS組親水性最好,PCL組親水性最差,三組混合支架隨PCL比例的增加逐漸減弱;體內(nèi)和體外降解檢測結(jié)果顯示五組支架均隨時間增長質(zhì)量逐漸降低,其中在第12周時,體外和體內(nèi)降解率分別為:PCL/PDS70/30組為21.44%、32.89%,PCL/PDS50/50組為32.29%、38.08%,PCL/PDS30/70組為36.81%、46.90%,PDS組為40.70%、61.11%,PCL組在體外和體內(nèi)幾乎均沒有降解;降解組織周圍炎癥反應(yīng)分析顯示PDS組和PCL/PDS混合支架引起的炎癥反應(yīng)較PCL組支架低,PCL比例越高炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重。2.體外培養(yǎng)的P3代HWJ-MSCs形態(tài)呈長梭形;細(xì)胞接種到支架上培養(yǎng)7天后CCK-8檢測顯示細(xì)胞在支架上黏附、增殖情況良好,PCL/PDS50/50組細(xì)胞增殖最好;Live/Dead染色檢測顯示細(xì)胞存活良好;SEM觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在支架上黏附并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì);鬼筆環(huán)肽染色觀察顯示細(xì)胞呈長梭形黏附在支架上。細(xì)胞支架復(fù)合物體外誘導(dǎo)后,Western-blot蛋白定量檢測結(jié)果顯示各組支架細(xì)胞分泌的Ⅰ型膠原及Aggrecan隨著時間的增加均明顯增加,且在第1周和第3周PCL/PDS70/30組和PCL/PDS50/50組的Ⅰ型膠原及Aggrecan量均高于PCL組(P0.05)。結(jié)論:1.采用PCL、PDS和熔融紡絲技術(shù)可以制備符合仿生斜交疊層結(jié)構(gòu)的纖維環(huán)支架,并具備優(yōu)越的力學(xué)性能、合適的降解速率和良好生物相容性。2.HWJ-MSCs接種到PCL/PDS可降解支架體外培養(yǎng)后生物活性良好,可以構(gòu)建仿生可降解組織工程纖維環(huán)。
【圖文】：

圖 1 實(shí)驗設(shè)備圖。A：熔融紡絲機(jī)及相關(guān)設(shè)備；B：微小力學(xué)測試儀1.1.4.3 仿生可降解組織工程支架的結(jié)構(gòu)和理化特性（1）支架的宏觀結(jié)構(gòu)將五組（截取長度為 5 mm）支架放置于體式顯微鏡下觀察，并記錄其宏觀結(jié)構(gòu)。（2）支架的微觀結(jié)構(gòu)將截取的支架用導(dǎo)電膠固定于樣品臺上，放置于噴金裝置內(nèi)，給予 10 mA電流，噴金時間 1 分鐘；將噴金后的樣本放置于掃描電子顯微鏡（SEM）內(nèi)，在 10 kV 的電壓下觀察、記錄五組支架的微觀結(jié)構(gòu)。其中，，每組支架選取至少3 個樣本，每個樣本選取 5 張電鏡照片，每張照片分別選取不同的位置多次測量支架纖維直徑（μm）、孔徑（μm）。（3）支架的孔隙率使用液體置換法測定孔隙率。將截取長度為5 mm的各組支架置入盛有75%醫(yī)用酒精的 5 ml 刻度量筒中完全浸泡，2 小時后小心取出支架，根據(jù)量筒內(nèi)酒精體積的前后變化，計算出支架孔隙率�？紫堵实挠嬎惴椒椋嚎紫堵�=（未浸

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文試驗數(shù)據(jù)都運(yùn)用 SPSS19.0 軟件工具執(zhí)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)解析結(jié)±標(biāo)準(zhǔn)的形式來表示（x±s），組間差異運(yùn)用單因素方差分析來比較別。P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。果 混合支架比例檢測過檢測，PCL/PDS70/30 組，PCL/PDS50/50 組，PCL/PDS30/70 組PDS 在混合支架中所占的百分比分別為 32.17±4.22 %，51.57±63.83 %，基本與制備混合支架時所投放的 PCL 和 PDS 質(zhì)量相符。的支架仍具備完整的支架形態(tài)和規(guī)律的纖維走形（如圖 2 所示）。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R318.08

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本文編號：2592944