【摘要】：作為有機(jī)體中一種廣泛分布的非特異性磷酸單酯酶,堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)催化多種底物(如核酸、蛋白質(zhì)和生物堿等)去磷酸化,對(duì)多種疾病的診斷具有重要的臨床意義。常見的ALP活性檢測(cè)方法有比色法、電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法和熒光法等。這些檢測(cè)方法一般基于儀器設(shè)備(如分光光度計(jì)、電化學(xué)傳感器、熒光光度計(jì)),具有穩(wěn)定、靈敏、自動(dòng)化、高通量等優(yōu)點(diǎn)。但這些方法需要專用檢測(cè)器、儀器體積龐大、設(shè)備昂貴,更無法實(shí)現(xiàn)便攜式現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題,本文的具體研究?jī)?nèi)容如下:1.堿性磷酸酶催化介導(dǎo)的電泳滴定理論與裝置基于移動(dòng)反應(yīng)界面電泳滴定(electrophoresis titration,ET)理論,提出了一種檢測(cè)ALP活性的新原理、新裝置與新方法。其原理主要在于,陰極孔中的ALP在堿性環(huán)境中能將4-甲基傘形酮磷酸酯二鈉鹽(4-MUP)水解成帶有負(fù)電荷的4-甲基傘形酮([4-MU]~-)。[4-MU]~-在紫外激發(fā)下能發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光,在電場(chǎng)作用下向陽極移動(dòng),并與芯片通道中的酸性離子發(fā)生中和反應(yīng),形成熒光移動(dòng)反應(yīng)界面(moving reaction boundary,MRB)。該MRB的移動(dòng)速度(V_(MRB))與ALP活性成正比,因而可通過測(cè)量V_(MRB)得到相應(yīng)ALP活性。該ALP-ET方法所需裝置十分簡(jiǎn)單便攜,僅由LED紫外燈、PMMA芯片、鉑電極和鋰電池組成。2.堿性磷酸酶催化介導(dǎo)的電泳滴定理論的驗(yàn)證為證明堿性磷酸酶催化介導(dǎo)的電泳滴定理論的合理性與可行性,開展了一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,陰極孔中ALP催化產(chǎn)物[4-MU]~-在電場(chǎng)作用下進(jìn)入芯片微通道,并與通道中的H~+發(fā)生中和反應(yīng),形成移動(dòng)中和反應(yīng)界面。而且隨著ALP活性增加,V_(MRB)也隨之加快。通過檢測(cè)不同活性ALP所對(duì)應(yīng)V_(MRB),得到了ALP活性與MRB移動(dòng)速率之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線:V_(MRB)=0.033A+3.87,R~2=0.9980,線性關(guān)系良好,其線性范圍為1.0-10.0 U/L。該方法靈敏度高(檢測(cè)限可達(dá)0.1 U/L),具有良好的選擇性,且精確度高(RSD值為2.7~6.8%,回收率為101~105%)。此外,還對(duì)ALP-ET裝置的關(guān)鍵部件鋰電池的穩(wěn)定性進(jìn)行了相關(guān)研究。當(dāng)鋰電池持續(xù)工作超過12小時(shí),其電壓仍可以維持在初始電壓的98%以上,也即只有不到2%的電壓衰減;當(dāng)180個(gè)通道同時(shí)運(yùn)行時(shí),鋰電池的電壓仍可維持在初始電壓98%以上至少60min。3.堿性磷酸酶催化介導(dǎo)的電泳滴定理論的應(yīng)用將該ALP-ET方法應(yīng)用于實(shí)際血清樣本ALP活性檢測(cè),以評(píng)估其應(yīng)用于臨床診斷的可能性。并與臨床所用檢測(cè)方法相比較,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明該兩種方法的檢測(cè)結(jié)果之間無顯著性差異。該方法檢測(cè)結(jié)果的可信度較高,而且能區(qū)分肝病患者和正常人。正釩酸鈉作為一種常見的ALP抑制劑,在多種人類癌細(xì)胞(包括肺癌,腎癌和前列腺癌)中表現(xiàn)出了抗腫瘤活性,因而本文也提供了基于ALP-ET理論的正釩酸鈉的檢測(cè)方法。結(jié)果顯示,隨著ALP抑制劑濃度的增加,MRB移動(dòng)速率隨之降低,呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的線性關(guān)系。其標(biāo)準(zhǔn)曲線為:V_(MRB)=-0.0159 C_(in)+1.9418(R2=0.9933),檢測(cè)限可達(dá)0.1Μm。本文提出的ALP-ET理論為正礬酸鈉濃度檢測(cè)、抗癌藥物的設(shè)計(jì)提供了新思路和新方法。
【圖文】：

圖 2-1 ALP-ET 方法原理示意圖。（A）ALP 將 4-MUP 水解為[4-MU]-；（B）在電泳滴定時(shí)間為 t0、t1和 t2時(shí)，，MRB 的移動(dòng)情況�！�+”和“-”分別表示離子所帶正電荷和負(fù)電荷。Fig. 2-1 Schematic illustration of ALP-ET chip model for measurement of ALPactivity via moving reaction boundary (MRB). (A) ALP-induced enzymaticcatalysisof 4-MUPto[4-MU]-; (B)Run ofETchipatrunningtime (t0)justbeforethe start of ET, (t1) and (t2). The symbols of “+” and “-” imply the anode and thecathode, respectively. Other symbols see the figure and context.2.3 ALP-ET 芯片裝置2.3.1 ALP-ET 芯片設(shè)計(jì)ET 微流控芯片作為 ALP 酶催化反應(yīng)、電泳滴定的操作和發(fā)生平臺(tái)，是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵部件之一。ALP-ET 芯片通過 AutoCAD 2016 (Autodesk Inc., USA)軟件進(jìn)

上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文芯片采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）材質(zhì)，該材質(zhì)易于加工，具有良好化學(xué)穩(wěn)定性、透光性和密封性。芯片的加工主要包括清洗、甩膠、曝光、顯影、膠、脫模、鍵合等步驟。芯片的主結(jié)構(gòu)使用 CNC 線切割機(jī)器生產(chǎn)，微通道采用壓成型方法加工而成。每個(gè)芯片可同時(shí)運(yùn)行 3 個(gè)電泳滴定，以用于平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：O652;R318

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本文編號(hào)：2592704