【摘要】：[背景和目的] 隨著生物材料被廣泛應用于臨床,生物材料植入感染(implant-associated infection)已經(jīng)成為令人棘手的常見醫(yī)院內(nèi)感染,有報道占醫(yī)院內(nèi)感染的50%,往往給患者帶來災難性后果。大腸桿菌是臨床生物材料植入感染優(yōu)勢菌種,在心臟瓣膜置換術、關節(jié)置換術、腦室腹腔分流術等術后生物材料植入感染中大腸桿菌檢出率為3～10%。 大腸桿菌(Escherichia coli)是人體腸道中的條件致病菌,心臟大血管手術體外循環(huán)期間、神經(jīng)外科或骨科等手術控制性降壓期間、以及臨床上常見的失血性休克,均可導致腸通透性升高及腸道細菌移位,造成菌血癥,血液中的細菌為細菌在生物材料表面黏附提供菌源。細菌在生物材料表面一旦形成細菌生物膜,就能有效地抵御機體的防御反應和抗生素的治療,是導致生物材料植入感染難以控制的根源。密度感應系統(tǒng)(quorum sensing system)在細菌生物膜形成過程中起重要作用。Sperandio等研究表明大腸桿菌密度感應調(diào)節(jié)子C (Quorum sensing E. coli regulator C, QseC)可以識別自誘導物3(AI-3)、腎上腺素(EPI)及去甲腎上腺素(NE)等信號分子,在浮游狀態(tài)時細菌的密度感應系統(tǒng)中起重要調(diào)節(jié)作用。然而,在腸道大腸桿菌移位引發(fā)的生物材料植入感染中,大腸桿菌QseC的作用如何,目前相關報道甚少。 本研究采用Red同源重組技術構建大腸桿菌K-12菌株qseC陰性突變菌株；在前期建立的聚氯乙烯材料表面細菌生物膜模型基礎上,采用激光掃描等技術,探討大腸桿菌QseC對生物材料表面細菌生物膜形成能力的影響；通過失血性休克建立腸道細菌移位動物模型,探討大腸桿菌QseC在腸道細菌移位引發(fā)生物材料植入感染中的作用；揭示防治大腸桿菌引發(fā)的生物材料植入感染的有效分子藥物靶標,為防治生物材料植入感染提供實驗依據(jù)。 [方法] 本研究分四部分： 1、應用Red同源重組技術構建大腸桿菌qseC陰性突變菌株：選用大腸桿菌K-12MC1000菌株為研究對象,應用PCR技術擴增兩翼與目的基因上下游同源、含有氯霉素抗性基因片段,電擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌MC1000。在阿拉伯糖誘導下,含有質(zhì)粒pKD46的菌株MC1000表達Red同源重組酶,利用含同源臂的氯霉素抗性片段置換目的基因qseC,并進一步利用FLP位點專一性重組將氯霉素抗性基因刪除。最后用鑒定引物行PCR對大腸桿菌qseC陰性突變菌株進行鑒定。所得突變菌株標記為qseC 2、大腸桿菌QseC在細菌生物學表型變化中的作用：測定大腸桿菌MC1000和MC1000ΔqseC的生長曲線,及其在泳動能力檢測培養(yǎng)基上的運動能力。探討大腸桿菌QseC在細菌生物學表型變化中的作用。 3、大腸桿菌QseC在生物材料表面細菌生物膜形成中的作用：以兩株大腸桿菌(MC1000菌株和MC1000ΔqseC菌株)為實驗菌株,在培養(yǎng)基中添加EPI或NE,建立PVC材料表面細菌生物膜體外模型。實驗中同時設置未經(jīng)EPI或NE處理的野生菌株和陰性突變菌株作為對照。采用半定量檢測方法測定大腸桿菌的細菌生物膜形成能力,應用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)動態(tài)觀察PVC材料表面大腸桿菌生物膜的形成過程、細菌群落數(shù)量及細菌生物膜厚度等,應用掃描電鏡(SEM)觀察PVC材料表面大腸桿菌細菌生物膜的表面結(jié)構。探討大腸桿菌QseC在PVC材料表面細菌生物膜形成中的作用。 4、QseC在腸道細菌移位并在生物材料表面細菌生物膜形成中的作用：SPF級健康雄性SD大鼠隨機分為6組：空白+假休克組(空白-Sham),空白+休克組(空白-HS),MC1000+假休克組(M-Sham), MC1000ΔqseC+假休克組(Δ-Sham),MC1000+休克組(M-HS),MC1000ΔqseC+休克組(Δ-HS),每組6只。將實驗菌株定植于大鼠腸道內(nèi),經(jīng)右下腹斜切口將PVC材料放入腹膜腔并建立失血性休克動物模型。在休克后24h處死大鼠,嚴格無菌條件下取門靜脈血和腸系膜淋巴結(jié)、肝脾標本行細菌培養(yǎng),采用平板菌落計數(shù)法計數(shù)細菌移位率及菌落數(shù),并根據(jù)組織重量換算為每克組織的菌落總數(shù)(CFU/g);通過PCR反應對細菌進行鑒定,證實細菌來自于大鼠腸道內(nèi)的實驗菌株；取出PVC材料片作細菌培養(yǎng)和鑒定,同時用SEM對材料表面細菌生物膜的形成情況進行觀察。 [結(jié)果] 1、大腸桿菌qseC陰性突變菌株的構建：PCR及DNA測序結(jié)果表明,qseC基因內(nèi)部序列已被刪除,且無氯霉素抗性基因,qseC基因已被成功敲除。 2、大腸桿菌QseC在細菌生物學表型變化中的作用：①MC1000和MC1000ΔqseC在LB培養(yǎng)基中的生長并無明顯差異；②MC1000和MC1000ΔqseC在LBEPI(或LBNE)培養(yǎng)基中的生長并無明顯差異；③相對于MC1000菌株,MC1000ΔqseC突變株的運動能力明顯下降(P0.05)；④MC1000菌株在LBEPI和LBNE培養(yǎng)基中的運動力較之在LB培養(yǎng)基中明顯增強(P0.05),而當存在EPI或NE時MC1000ΔqseC突變株的變化無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3、大腸桿菌QseC在生物材料表面細菌生物膜形成中的作用：①PVC材料表面大腸桿菌生物膜的形成過程：PVC材料表面細菌群落數(shù)量及細菌生物膜厚度隨時間的變化而變化,培育18-24h時細菌群落數(shù)量達到高峰,培育24h“時細菌生物膜厚度達到峰值；②QseC在PVC材料表面細菌生物膜形成中的作用：與MC1000組相比,MC1000ΔqseC組PVC材料表面大腸桿菌生物膜的形成能力明顯降低(P0.05),單位面積細菌群落數(shù)量減少(P0.05),細菌生物膜厚度明顯減小(P0.05)；③EPI(或NE)對PVC材料表面大腸桿菌細菌生物膜形成的影響：添加EPI或NE后PVC材料表面MC1000細菌生物膜的形成能力明顯增強(P0.05),而添加EPI或NE后PVC材料表面MC1000ΔqseC細菌生物膜的形成能力并無明顯改變(P0.05)。 4、QseC在腸道細菌移位并在生物材料表面細菌生物膜形成中的作用：①在大鼠門靜脈血、腸系膜淋巴結(jié)、肝脾組織內(nèi)以及PVC材料片上,均分離出耐鏈霉素細菌,經(jīng)PCR證實這些細菌就是來自于灌飼到大鼠腸道的實驗菌株；②Δ-HS組大鼠細菌移位率和內(nèi)臟組織細菌含量都比M-HS組明顯降低(P0.05);③Δ-HS組大鼠PVC材料上的細菌含量較之M-HS組有明顯降低(P0.05)。 [結(jié)論] 1、大腸桿菌QseC缺失后運動能力顯著下降。兒茶酚胺對大腸桿菌運動能力有直接促進作用,而且該作用是通過QseC介導的。 2、生物材料表面大腸桿菌生物膜的形成是一個動態(tài)過程,生物材料表面細菌群落數(shù)量及細菌生物膜厚度的增加與時間的變化相關,這可能與生物材料植入感染的臨床感染特征有關。 3、大腸桿菌QseC在生物材料表面細菌生物膜的形成中具有重要作用。兒茶酚胺對大腸桿菌在生物材料表面細菌生物被膜的形成有直接促進作用,而且該作用是通過QseC介導的。 4、大腸桿菌QseC缺失后,運動能力降低,同時QseC信號鏈中斷,細菌對腸粘膜的侵襲力和穿透力減弱,導致細菌移位發(fā)生率下降。QseC-1腎上腺素信號通路在腸道大腸桿菌移位并在生物材料表面定植中起重要作用。
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R639;R318.08

【參考文獻】

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本文編號：2559176