【摘要】：血管移植是目前血管病治療的一種普遍手術(shù)方法,由于自體血管移植存在種種缺陷,因此應(yīng)用細胞或不應(yīng)用細胞的組織工程血管支架在體外試驗中被研制。但是這類方法制作的血管花費大量的時間,并不適用于緊急治療的需要。而目前臨床應(yīng)用的人造血管由于易于急性血栓形成往往限于直徑較大血管,且遠期研究內(nèi)皮化率較低,小口徑人造血管易于血栓的高形成率目前尚無法適用臨床治療。具有生物活性的組織工程血管支架(TEVG)如果要用于血管移植對材料和其攜帶的生物活性物質(zhì)的高組織相容性提出要求。在本研究中我們闡述了應(yīng)用靜電紡絲技術(shù),同時采用高分子聚合材料PLLA/PCL,一步法制作的具有生物活性、人工合成、可降解、高組織相容性并具有細胞外基質(zhì)特性的小口徑組織工程血管支架,同時將這一新型血管支架移植于動物體內(nèi),并通過體內(nèi)外實驗研究其在原位血管重建的功能,同時發(fā)現(xiàn)這類新型血管支架在重建過程中具有同時吸引兩種干細胞的功能。 第一部分靜電紡絲PLLA/PCL小口徑血管支架的制作和特性研究 目的：應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)選折合適材料制作具有生物力學(xué)特性的組織工程血管支架。 方法：使用高分子可降解材料左旋聚乳酸/聚己酸內(nèi)酯以19%/5%的質(zhì)量比例濃度混合物和單純左旋聚乳酸分別溶解于六氟異丙醇,應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)電紡于直徑為1mm的圓柱形棒狀接收屏,制成組織工程血管支架,在掃描電鏡分析紡絲直徑并測試其機械力學(xué)特性。 結(jié)果：1.濃度為19%PLLA/5%PCL溶液靜電紡所得的纖維平均直徑982.3nm符合納米材料的直徑要求。2.靜電紡所得組織工程血管支架平均內(nèi)徑1.000mm±0.013mm,平均外徑1.302mm±0.021mm,平均厚度150.1μm±10.5μm。3.19%PLLA/5%PCL支架平均楊氏模量為5.19±0.7Mpa,19%PLLA和自體血管分別為12.85±0.11Mpa、9.66±0.13Mpa,具有顯著差異P0.05。 結(jié)論：采用靜電紡絲技術(shù)制備的組織工程小口徑血管支架的纖維寬度及空隙達到納米材料級別。PLLA/PCL的抗拉性和延展性明顯優(yōu)于單純PLLA和自體血管,是較為理想的生物材料。PLLA/PCL支架的最大受力顯著優(yōu)于單純PLLA材料,但較自體血管小。 第二部分肝素-SDF-1α交聯(lián)的組織工程血管支架的藥物釋放及移植后物理特性研究 目的：應(yīng)用共價鍵化合特性將肝素交聯(lián)與血管支架上,基于肝素可與SDF-1α靜電電荷作用原理交聯(lián)SDF-1α于血管支架上,并檢測其穩(wěn)定性。使用采用血管內(nèi)直徑為1mm TEVG,應(yīng)用端端吻合技術(shù)植入SD大鼠的頸總動脈內(nèi),研究其血管通常率和生物組織力學(xué)改特性的變。 方法：使用0.01N NaOH處理支架表面以增加羧基密度后應(yīng)用碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺供價連接與羧基,使用聚乙二醇二胺作為肝素連接分子將肝素交聯(lián)于TEVG,用甲苯胺藍染色法測定肝素的釋放。SDF-1α與肝素相互作用后與肝素交聯(lián),通過酶聯(lián)免疫吸附測定測定SDF-1α的釋放。免疫組化觀察不同濃度的SDF-1α交聯(lián)后的染色強度。應(yīng)用端端吻合技術(shù)吻合TEVG于SD大鼠左頸總動脈之上,多普勒超聲驗證各時間點血管通暢程度,各時間點取出支架后測試機械力學(xué)特性。 結(jié)果：通過甲苯胺藍試劑法測定,平均每個PLLA/PCL支架肝素含量濃度為15.31±2.31μg/mm3。通過夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗測定,以500ng/mlSDF-1α起始交聯(lián)濃度,平均每個PLLA/PCL支架SDF-1α含量濃度為140.5±4.1nng/mm3。SDF-1α交聯(lián)的起始溶液濃度和支架SDF-1α的結(jié)合濃度呈等比關(guān)系。手術(shù)結(jié)束即刻通暢率為100%,肝素-SDF-1α組在除在第一周通暢率與肝素組接近外(88.9%),其余各個時間點肝素-SDF-1α組的通暢率最高P0.05,肝素組的通暢率也高于空白對照組P0.05。肝素-SDF-1α組支架在4周后的機械強度與自體血管較為接近,達到了組織工程血管支架的力學(xué)要求,各時間點肝素-SDF-1α生物力學(xué)特性明顯優(yōu)于其他兩組(P0.05)。 結(jié)論：19%PLLA/5%PCL二元共混靜電紡絲,具有良好的肝素交聯(lián)性能。肝素化PLLA/PCL支架可高效結(jié)合SDF-1α,制備有效的具有生物活性TEVG, SDF-1α起始交聯(lián)濃度可定為500ng/m1。肝素-SDF-1α組的TEVG近期及遠期通暢率均明顯高于肝素組和空白對照組。肝素-SDF-1α組的TEVG在4周內(nèi)其彈性強度(彈性模量)接近并超過了自體血管的強度,肝素組和空白對照組在12周后彈性模量也接近了自體血管,19%PLLA/5%PCL的TEVG在植入體內(nèi)后其生物力學(xué)特性可接近自然血管。 第三部分血管支架內(nèi)表面內(nèi)皮化功能的研究 目的：通過體內(nèi)、體外實驗研究生物活性組織工程血管支架內(nèi)皮化效率和機制。 方法：1.體外試驗：體外培養(yǎng)牛內(nèi)皮細胞,M199培養(yǎng)液中加入不同濃度的SDF-la溶液,研究不同濃度SDF-1α對內(nèi)皮細胞遷移能力的影響。2.取出不同時間點的TEVG,應(yīng)用免疫組化方法分析TEVG內(nèi)表面的內(nèi)皮化率和內(nèi)皮化機制。 結(jié)果：對照組、肝素組15μg/ml、SDF-1α組濃度分別為20ng/ml、50ng/ml、150ng/ml時,ECs細胞遷移數(shù)分別為3.5±0.58個,7.9±1.09個,18.3±1.73個,24.7±2.05個,31.1±2.46個,具有顯著差異P0.05。1周的SDF-1α組TEVG內(nèi)表面吸引更多的細胞(1570±413mm2,n=3),具有顯著差異性P0.05,且可以觀察到大量CD34+/CD133+/CD31-的EPCs聚集于內(nèi)表面。4周的SDF-1α組內(nèi)皮化率高于其他兩組,CD34/CD133表達下調(diào),內(nèi)皮細胞成熟。 結(jié)論：1.體外試驗SDF-1α可有效吸引內(nèi)皮細胞的遷移,證明SDF-1α可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞遷移。2.肝素-SDF-1α交聯(lián)組的組織工程血管(TEVG)可有效的全程吸引內(nèi)皮祖細胞(EPCs),在4周內(nèi)即有效全程內(nèi)皮化。 第四部分血管支架外表面的研究 目的：通過體內(nèi)、體外實驗研究生物活性組織工程血管支架對平滑肌祖細胞的吸引能力和平滑肌細胞分化成熟的能力研究。 方法：1.體外試驗：手術(shù)取出各組種植3天TEVG體外細胞培養(yǎng)并鑒定細胞,并用Real-time PCR的檢測各時間點平滑肌細胞特異標記物α-SMA、CNN1對應(yīng)的基因表達。2.體內(nèi)實驗：免疫熒光法檢測各個時間點各組外周組織的α-SMA、 MHC、CNN1、Sox10、Sox17表達,計算陽性細胞率,Verhoeff s彈力蛋白染色檢測第4周時TEVG外周組織彈力蛋白和膠原蛋白的表達。 結(jié)果：1.體外試驗：細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)除肝素-SDF-1α組外,肝素組和對照并無α-SMA陽性表達細胞生長。1周細胞僅表達α-SMA,而CNN1和MHC均為陰性表達,4周細胞表達α-SMA同時CNN1和MHC表達大幅增高,Real-time PCR的結(jié)果顯示隨著時間推移細胞的α-SMA和CNN1的mRNA的表達逐漸增加,統(tǒng)計分析具有顯著差異P0.01。2.體外試驗：1周TEVG外層組織SDF-1α組α-SMA的陽性細胞率為87.2±5.1%(n=3),明顯高于肝素組64.2±4.2%(n=3)和對照組46.2±3.7%(n=3),統(tǒng)計有顯著差異P0.05,4周時肝素-SDF-1α組CNNl和MHC的陽性細胞率為89.7±4.9%(n=5)高于肝素組72.3±3.4%(n=4)和對照組31.2±2.7%(n=3),統(tǒng)計有顯著差異P0.05。4周外層組織雙染COL1/MHC,分析兩種蛋白表達我們發(fā)現(xiàn)肝素-SDF-1α組的COL1密度明顯高于對照組和肝素組,Verhoeff's彈力蛋白染色表面肝素-SDF-1α組彈性蛋白和膠原明顯高于其他組。 結(jié)論：1.通過體外實驗發(fā)現(xiàn)一種Sox10+/Sox17+/CD34-的具有平滑肌祖細胞特性的干細胞。2.體內(nèi)外實驗證實肝素-SDF-1α交聯(lián)的TEVG具有強大的平滑肌祖細胞吸引功能,并刺激平滑肌祖細胞向平滑肌細胞方向分化、增殖,表達相關(guān)蛋白產(chǎn)物。
【圖文】：

Microfiber圖1-1 肝素_SDF-la交聯(lián)示意圖1. 2 材料和方法1.2.1實驗材料左旋聚乳酸(Poly — L_lactic acid, PLLA),分子量 67400，由 Sigraa-Aldrich公司提供。聚己酸內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL),分子量 2000，由 Polysciences公司提供。六氟異丙醇（1，1, 1，3, 3，3-Hexafluoro-2-propanol , HFIP),由 Aladdin公司提供。聚乙二醇二胺(NH2-PEG-NH2)，由 Sigraa-Aldrich 公司提供。碳化二亞胺(EDC)

1.2. 3.2 靜電紡絲裝置、原理及方發(fā)靜電紡絲裝置如圖1一2所示，利用高壓直流電源提供高壓電源，正極輸出的電極連接于注射器針頭。圓柱形棒狀接收屏（直徑為1.0mm，長8cm) —端與陰極相連，，圓柱形棒狀接收屏與針頭距離為9cra,另一端與有旋轉(zhuǎn)和平行動程的動力裝置導(dǎo)管成型機相連。導(dǎo)管成型機旋轉(zhuǎn)最大速度為1000r/min[28]�！窼oiulion、"eservcir Nozzle .— Fiber jeti ?、 / ^ 嚴 Static DCvcltage Translation圖1 — 2靜電紡絲裝置示意圖(1)如圖1-2連接注入19%PLLA/5%PCL及19%PLLA混合溶液的于3ml注射器微量泵固定，設(shè)置速度Iml/hr，注射量為0.15ml，圓柱形棒狀接收屏(直徑為1.0mm，長Son)兩端與動力裝置導(dǎo)管成型機相連接
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R318.08;R654

【共引文獻】

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本文編號：2537715