【摘要】：羊膜上皮細胞(Amniotic Epithelial Cells,AECs)來自于胎盤內(nèi)層羊膜。羊膜組織主要由來源于外胚層的羊膜上皮細胞(AECs)和來源于中胚層的羊膜間充質(zhì)細胞(amniotic mesenchyme cells,AMCs)兩類細胞組成。已有研究成果證明羊膜上皮細胞仍保持前原腸胚時期胚胎細胞的可塑性和多能性,具有三種胚原基層細胞的分化潛能,能夠分化成為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層細胞。早在40年前科研人員已經(jīng)在羊水中發(fā)現(xiàn)了干細胞,2003年科研人員又發(fā)現(xiàn)羊水中的某些細胞能夠表達干細胞全能性標志性基因Oct4。2005年美國University of Pittsburgh的Miki等報道了hAECs具有胚胎干細胞的特性,并證實hAECs和胚胎干細胞一樣表達特異性轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)“Oct4”和“Nanog”基因。hAECs取材方便、來源廣泛、易于培養(yǎng)、免疫原性低、不形成畸胎瘤,成為再生醫(yī)學組織工程學和細胞替代治療領(lǐng)域非常有應(yīng)用前景的生物工程材料。目前人羊膜細胞的研究取得了顯著成果,臨床上已經(jīng)用于治療肝病、心臟病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、肺病等多種疑難雜癥。近幾年動物羊膜細胞的研究工作也取得了明顯的進展,到目前為止,綿羊羊膜和羊水干細胞、豬羊水干細胞、馬羊水干細胞、水牛羊水干細胞、牛羊膜和羊水干細胞等都已經(jīng)分離成功。馬羊膜上皮細胞(equine Amniotic Epithelial Cells,eAECs)研究報道的資料較少,而有關(guān)eAECs分離、培養(yǎng)和鑒定等研究內(nèi)容尚未見報道。本論文采用Trypsin和TrypLE消化羊膜上皮細胞層獲得eAECs,在一定條件下進行體外培養(yǎng),通過免疫熒光染色、流式細胞技術(shù)、RT-PCR檢測等方法對eAECs表達上皮細胞表面抗原、干細胞表面抗原進行鑒定,并進一步對eAECs體外和體內(nèi)的分化潛能進行研究,來評估馬羊膜干細胞在臨床治療方面的應(yīng)用前景。實驗首先對馬羊膜上皮細胞(eAECs)進行分離與培養(yǎng)。目前還沒有關(guān)于馬羊膜上皮細胞(eAECs)消化分離及體外培養(yǎng)實驗方法的報道。本實驗以人羊膜上皮細胞消化分離方法為參考依據(jù),建立了馬羊膜上皮細胞(eAECs)消化分離的實驗方法,并對Trypsin和TrypLE在eAECs分離培養(yǎng)過程中的影響作用做了相關(guān)的研究。實驗結(jié)果顯示Trypsin和TrypLE都可以從馬羊膜層消化分離獲得上皮原代細胞,但TrypLE更有利于馬羊膜上皮細胞的分離消化,獲得的細胞活力高,對以后的細胞傳代培養(yǎng)影響較小,更適宜于后續(xù)的細胞培養(yǎng)、鑒定和分化潛能的研究。實驗采用90%fbs+10%dmso的細胞冷凍液體系凍存細胞效果較好,將細胞懸液和凍存液混合放入凍存管后置于異丙醇冷凍盒內(nèi),-80℃條件下過夜,第二天轉(zhuǎn)入液氮長期保存以備實驗使用。實驗過程發(fā)現(xiàn)羊膜上皮細胞在體外培養(yǎng)時出現(xiàn)了三種細胞類型,上皮樣細胞、間充質(zhì)樣細胞、半貼壁園形細胞。經(jīng)trypsin消化分離獲得的馬羊膜上皮細胞在初代和第一代培養(yǎng)時,其倍增時間較tryple分離獲得的細胞的倍增時間長,而以后傳代細胞的倍增時間兩者沒有明顯差異,在體外培養(yǎng)馬羊膜上皮細胞的倍增時間平均為1.25天左右。實驗進一步對馬羊膜上皮細胞(eaecs)進行鑒定。第二代馬羊膜上皮細胞經(jīng)過免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)ssea-1、ssea-3、ssea-4、tra-1-60和tra-1-81均在細胞質(zhì)中呈陽性表達;oct4在細胞核中呈陽性表達;rt-pcr檢測表明馬羊膜上皮細胞(eaecs)在mrna水平上表達胚胎干細胞標志性基因oct4、nanog和sox2;流式細胞術(shù)檢測(facs)發(fā)現(xiàn)馬羊膜上皮細胞(eaecs)表達上皮細胞特異性表面抗原cd44、cd90、cd105,但不表達骨髓上皮細胞cd45。這些結(jié)果表明,實驗分離得到純度較高的馬羊膜上皮細胞,且馬羊膜上皮細胞表達胚胎干細胞自我更新和標志性基因,具有干細胞特征,可以認為馬羊膜上皮細胞(eaecs)是馬羊膜上皮干細胞(eaescs)。最后實驗對馬羊膜上皮細胞(eaecs)分化潛能進行探索性研究。實驗通過體外培養(yǎng)向三胚層自發(fā)分化和給scid小鼠注射馬羊膜上皮細胞(eaecs)的體內(nèi)分化實驗對馬羊膜上皮細胞(eaecs)分化潛能進行研究。在體外懸浮培養(yǎng)馬羊膜上皮細胞,20天后發(fā)現(xiàn)形成了類胚體,經(jīng)rt-pcr檢測發(fā)現(xiàn)馬羊膜上皮細胞在體外自發(fā)分化的細胞都表達外胚層、中胚層和內(nèi)胚層三個胚層的標志性基因β-tubuliniii、gata-4和α-fetoprotein。在給scid小鼠皮下注射馬羊膜上皮細胞后,30-90天之間沒有發(fā)現(xiàn)畸胎瘤發(fā)生;而對照組給scid小鼠皮下注射了商品化的小鼠胚胎干細胞,90天后處死小鼠后檢查發(fā)現(xiàn)有畸胎瘤形成,結(jié)果表明實驗分離獲得的馬羊膜上皮細胞(eaecs)免疫原性低于小鼠胚胎干細胞,更適合臨床治療的研究。綜上所述,本實驗獲得了具有干細胞特征的馬羊膜上皮細胞(eaecs),初步建立了消化分離的實驗方法;并對馬羊膜上皮細胞的體內(nèi)、體外分化潛能及免疫原性進行了探索性研究。實驗結(jié)果表明馬羊膜上皮細胞(eaecs)可以向三個胚層的細胞分化,這為今后再生醫(yī)學和組織工程學通過干細胞定向治療臨床上所需的細胞或組織器官提供了新的實驗基礎(chǔ)和依據(jù),對以后開展其它動物羊膜上皮細胞的研究也有積極的借鑒意義,使得人們對馬羊膜上皮細胞(eAECs)的認識又前進了一步。
【圖文】：

圖 2-1. 馬胎衣、羊膜和絨毛膜的比較圖A: 馬完整胎衣（包括羊膜、絨毛膜和胎盤組織）B: 血管分布少的胎膜。黑色箭頭所指為羊膜上皮層；白色箭頭所指為絨毛膜，其上血管較多。Fig. 2-1. The comparison of afterbirth, amniotic membrane and chorionic.A: The complete afterbirth (including amniotic membrane, chorionic and placental tissue). B: The membrane with less vasculardistribution. The black arrow designates the amniotic membrane cortex; White arrow designates the chorion with more blood vessels.在無菌條件下，取實驗材料將羊膜上皮層從絨毛膜上機械剝離下來，置于高壓滅菌的500ml含0.3 mg/ml 慶大霉素的生理鹽水中洗滌3次。剔除羊膜層上殘留的血管，清洗 3 次后，在 70%消毒酒精中浸泡 5s，然后再用 D-PBS 反復沖洗。最后將羊膜剪成大約 10cm2小塊，置于 500ml 無菌試劑瓶中，稱重后用于細胞消化實驗。用同樣的方法將所有的羊膜分離完成后，無菌條件下冷凍存放備用。2.2.2 Trypsin-EDTA 或 TrypLE 消化分離馬羊膜細胞在準備好的 500ml 無菌試劑瓶按每克羊膜加入 1 ml 0.25%Trypsin-EDTA 或者TrypLE，充分混勻后置于預(yù)熱到 37℃的空氣恒溫搖床中，進行消化分離實驗。

38馬羊膜上皮細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及分化潛能的研究2.3.2 馬羊膜上皮細胞的培養(yǎng)本實驗采用 Trypsin 或者是 TrypLE 分別消化分離所獲得的馬羊膜細胞液在體培養(yǎng)時，P0 細胞在顯微鏡下觀察到了 3 種形態(tài)的細胞，即為半貼壁圓形細胞、貼上皮樣細胞和貼壁間充質(zhì)樣細胞，，說明消化分離所獲得的細胞液是一個混合細胞（圖 2-3）。
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：Q813.1;R318.08

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