【摘要】：干細胞(stem cells)維持著生命體組織器官的發(fā)生發(fā)展以及損傷的修復與再生,隨著近年來再生醫(yī)學的迅猛發(fā)展,干細胞治療在臨床中的應用日益廣泛,療效顯著,已成為很多難治性疾病的終極治療手段,干細胞的研究已經(jīng)成為全國乃至全世界的研究熱點。在下文中我們將以毛囊干細胞這一成體干細胞為研究主體,對其生物學特性及其在再生醫(yī)學中的應用進行研究實驗,以期證明毛囊干細胞為再生醫(yī)學干細胞治療的理想干細胞源。 實驗目的： 1.體外分離培養(yǎng)并擴增毛囊干細胞(hair follicle stem cells,HFSCs),建立一種快速高效的細胞培養(yǎng)體系,為后續(xù)試驗奠定基礎； 2.通過體外誘導實驗,將HFSCs定向誘導為皮脂腺細胞及表皮角質(zhì)形成細胞,驗證HFSCs的多分化潛能； 3.證實HFSCs經(jīng)過特殊共培養(yǎng)體系誘導后,可以分化為汗腺樣細胞(sweat gland cells,SGCs),并可參與汗腺(sweat gland,SG)的修復與再生； 4.以HFSCs為種子細胞構(gòu)建結(jié)構(gòu)和功能更趨于完整的組織工程全層皮膚。 實驗方法： 1.分別用“酶消化-毛囊剝離-直接種植法”及“酶消化-毛囊剝離-酶消化”兩種方法體外分離HFSCs,并將毛囊組織或細胞植入鋪有IV型膠原,以絲裂霉素C處理過的成纖維細胞為飼養(yǎng)層的transwell雙層細胞培養(yǎng)板中,觀察對比兩組中細胞的形態(tài)、生長特性、及體外擴增能力的異同,并通過CD200、CD29、CK15等HFSCs特異性標記物的免疫細胞化學染色、免疫細胞熒光染色及流式細胞技術(shù),分析、鑒定分離培養(yǎng)的HFSCs; 2.分別建立兩種不同的體外細胞誘導體系,將HFSCs分別誘導分化為皮脂腺細胞、表皮細胞,并通過皮脂腺細胞及表皮細胞特異性標記物的免疫細胞化學、免疫細胞熒光染色及脂質(zhì)的油紅O染色,對誘導后細胞進行表型分析與鑒定； 3.體外分離培養(yǎng)人手掌或腳掌來源的SGCs及真皮間充質(zhì)干細胞(dermal mesenchymal stem cells,d-MSCs),利用transwell細胞培養(yǎng)板建立了一種特殊的HFSCs共培養(yǎng)體系,主要由熱休克的SGCs及一種仿真皮結(jié)構(gòu)的間質(zhì)組織構(gòu)成,我們又稱之為間質(zhì)飼養(yǎng)層(mesenchymal feeder layer, M-FL)主要包括d-MSCs、 Matrigel基質(zhì)膠以及一定比例的優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS),同時設立兩個對照組,對照組1中不包含熱休克SGCs,對照組2中不包含M-FL；細胞經(jīng)過誘導后,應用免疫細胞化學,免疫細胞熒光染色及流式細胞技術(shù)對誘導后細胞進行SGCs表型鑒定,對比實驗組、對照組1、對照組2中細胞的表型變化情況,同時,通過臺盼藍拒染實驗觀察各組細胞的生長活性,Edu(5'-ethynyl-2'-deoxyuridine)標記技術(shù)對比分析各組中細胞的增殖能力； 4.體外建立裸鼠腳掌燙傷模型,將HFSCs誘導來源的汗腺樣細胞(induced-sweat gland cells, i-SGCs)移植到裸鼠腳掌的燙傷部觀察,并以等量Nacl注射作為對照組,4周后,愈合創(chuàng)面全層皮膚取材,汗腺特異性標記物癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)、細胞角蛋白14(cytokeratin14, CK14)的免疫組化及免疫熒光染色分析判斷,觀察接受細胞移植的創(chuàng)面皮膚中是否有新生的汗腺結(jié)構(gòu)存在； 5.蛋白印跡法(western bolt)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)及實時熒光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR)檢測分析HFSCs誘導前、后的外胚層發(fā)育不良(ectodermal dysplasia,EDA)基因及其受體(ectodermal dysplasia receptor,EDAR)的基因及蛋白表達的變化,以進一步探索HFSCs分化為SGCs的分子機制； 6.分別以HFSCs (A組),表皮干細胞(epidermal stem cells,ESCs)(B組)為種子細胞體外建立組織工程學全層皮膚,通過伊紅-蘇木素(hematoxylin-eosin staining, HE)染色分析兩組標本形態(tài)結(jié)構(gòu)的異同,觀察A組標本中是否有毛囊樣結(jié)構(gòu)形成；兩組標本分別進行integrin β1(CD29)、細胞角蛋白19(cytokeratin19, CK19)免疫組織化學染色,觀察陽性細胞分布多少及分布區(qū)域。 實驗結(jié)果： 1.“酶消化-毛囊剝離-直接種植法”及“酶消化-毛囊剝離-酶消化”兩種細胞分離方法對比結(jié)果顯示：應用前一種方法培養(yǎng)的第一代細胞生長至80-90%融合的時間為13～14天,而后一種方法為8～9天,但是傳代后,從第二代細胞開始,兩組細胞的生長速度及增殖能力無明顯差異,無統(tǒng)計學意義(p0.05) 2.經(jīng)過特異性微環(huán)境的誘導,HFSCs分別被誘導分化為上皮膜抗原(EMA)及油紅染色陽性的皮脂腺細胞,以及細胞角蛋白10(cytokeratin10, CK10)陽性的角質(zhì)形成細胞； 3.在HFSCs汗腺化誘導實驗中,實驗組中,有一部分HFSCs最終被定向誘導分化成為具有汗腺表型的細胞,對比之下,對照組1中沒有細胞分化為SGCs.對照組2中只有極少部分細胞發(fā)生了向SGCs的轉(zhuǎn)化；我們利用細胞的特異性標記物,通過免疫熒光染色及流式細胞技術(shù)鑒定誘導后細胞,發(fā)現(xiàn)在這些細胞中HFSCs特異性標記物CD200、CD29及CK15的表達變?nèi)趿?而汗腺細胞特異性標記物CEA和CK14的表達卻增強了,這說明HFSCs在設計的共培養(yǎng)微環(huán)境中可以實現(xiàn)向SGCs的分化； 4. western blot結(jié)果顯示分化而來的SGCs高表達EDA和EDAR,RT-PCR及實時熒光定量PCR分析顯示EDA基因及EDAR基因在誘導后SGCs中呈高表達狀態(tài)；而CD29、CD200等HFSCs特異性抗原基因在汗腺化誘導后表達降低； 5.在隨后的細胞移植實驗中,接受了細胞注射的裸鼠燙傷腳掌的愈合創(chuàng)面,我們發(fā)現(xiàn)了類似SG的新生結(jié)構(gòu),進而行SGCs特異性標記物的免疫組織化學染色及免疫熒光染色,結(jié)果顯示這些類似汗腺的結(jié)構(gòu)對CEA、CK14呈陽性表達,而在Nacl注射組的創(chuàng)面標本中,沒有發(fā)現(xiàn)這種類汗腺結(jié)構(gòu)的存在。 6.在以HFSCs為種子細胞的A組及以ESCs為種子細胞的B組標本中,HE染色結(jié)果顯示,兩組標本均由表皮和真皮組成,二者之間以基底層相連接,基底層細胞排列較為整齊,細胞偏大,有CK19+和CD29+細胞散在分布；兩組間標本對比顯示：A組標本中,表皮層相對于B組較厚,分層較多,而且部分標本在基底層下方有毛囊樣結(jié)構(gòu)形成,表皮與真皮結(jié)合較緊密；B組標本對比A組來說,表皮層較薄,分層較少,表皮真皮易分離,基底層附近CK19+和CD29+陽性細胞較A組標本少,基底層下淺真皮層中無毛囊樣結(jié)構(gòu)形成 實驗結(jié)論： 1. HFSCs可以在體外適宜的微環(huán)境中被分離、培養(yǎng)、擴增；其中“酶消 化-毛囊剝離-酶消化”法較“酶消化-毛囊剝離-直接種植”法縮短了原代細胞的培養(yǎng)時間,在實驗中更具優(yōu)勢； 2. HFSCs具有多分化潛能,可以在體外被誘導分化為皮脂腺細胞及表皮角質(zhì)形成細胞； 3. HFSCs可以在適宜的微環(huán)境中,被誘導分化為SGCs; HFSCs作為一種成體干細胞,有用于治療汗腺缺失的潛能；我們建立的共培養(yǎng)誘導體系可以有效的將HFSCs定向誘導分化為SGCs,其分子機制與EDA/EDAR基因的激活有關；誘導分化而來的汗腺細胞是有功能的,可以參與皮膚創(chuàng)面中汗腺的再生； 4.以HFSCs為種子細胞有望構(gòu)建出富含皮膚附屬器的,形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能更趨于完善的組織工程全層皮膚。
【學位授予單位】：南開大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08

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本文編號：2518279