【摘要】：第一部分溫敏性羥丁基殼聚糖生物安全性研究細胞實驗研究目的:針對課題組在國內(nèi)首次制備具有溫敏特性的殼聚糖衍生物-羥丁基殼聚糖(HBC)水凝膠,通過該材料在體外對成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞生長影響的研究,探討該材料的細胞學行為,為材料的最終臨床應用提供細胞學實驗依據(jù)。研究方法:1.HBC浸提液對小鼠成纖維細胞(L929)的影響于37℃下將HBC水凝膠浸提于DMEM培養(yǎng)液24小時得浸提液。設置陰性對照組、苯酚陽性對照組及25%、50%、75%、100%濃度浸提液四個實驗組,設3塊96孔培養(yǎng)板,10孔平行對照組,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于1天、2天、4天后在倒置顯微鏡下觀察L929細胞生長情況,通過MTS法測定吸光度OD值,計算出不同組細胞的存活率。將L929細胞分別用陰性對照液、50%HBC浸提液及100%HBC浸提液進行培養(yǎng),3天后用流式細胞學的方法檢測L929細胞凋亡情況。2.HBC浸提液對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)和人肺成纖維細胞(HLF)的影響設25%、50%、75%、100%HBC浸提液4個實驗組和陰性對照組,將人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)和人肺成纖維細胞(HLF)在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),每個實驗孔內(nèi)加入100μl待測液,設3塊96孔培養(yǎng)板,10孔平行對照組,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1天、2天、4天后在倒置顯微鏡下觀察兩種細胞的生長情況,通過MTS法測定HUVEC細胞的吸光度OD值,計算出不同濃度組HUVEC細胞的存活率。研究結果:在HBC浸提液L929細胞毒性實驗中,25%、50%和75%、100%濃度的浸提培養(yǎng)液組及陰性對照組細胞死亡情況較苯酚陽性對照組有顯著差異(P0.001),HBC浸提液可明顯抑制L929細胞的生長,促進其凋亡。流式細胞學檢測:HBC浸提液可以將L929細胞部分阻礙在G1期向S期分化過程中(P0.05),驗證了其凋亡存在性。HBC浸提液對HUVEC無細胞毒性,且100%浸提液對于HUVEC細胞較陰性對照組有輕度促進生長作用(P0.001)。通過觀察發(fā)現(xiàn)第4天HLF細胞也出現(xiàn)了與L929細胞相似的凋亡細胞學形態(tài)。結論:溫敏性羥丁基殼聚糖(hbc)未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞毒性,可促進血管內(nèi)皮細胞的生長,但對成纖維細胞有一定的抑制作用。第二部分溫敏性羥丁基殼聚糖生物安全性研究動物實驗研究目的:本研究使用羥丁基殼聚糖(hbc),研制出一種新型可原位注射、溫敏性凝膠系統(tǒng)。通過動物體內(nèi)急性毒性實驗、致熱原實驗、皮內(nèi)刺激實驗、免疫毒性實驗等,初步評價該材料的生物安全性,為材料的最終臨床應用提供動物實驗依據(jù)。研究方法:1.急性毒性實驗將hbc水凝膠在生理鹽水下浸提24小時后,濾去沉淀,得到hbc生理鹽水浸提液。將清潔級健康sd大鼠隨機分為實驗組及對照組,每組各5只,通過尾緣靜脈以0.1ml/s的速度、50ml/kg的劑量注射入實驗組大鼠體內(nèi),觀察大鼠死亡情況。2.致熱原實驗通過耳緣靜脈將上述hbc生理鹽水浸提液以0.1ml/s的速度、2.5ml/kg的劑量注射入7只清潔級新西蘭兔體內(nèi)后,觀察體溫變化情況。3.皮內(nèi)刺激實驗將4種不同的待測液(100%hbc浸提液、50%hbc浸提液、生理鹽水、苯酚溶液)通過皮內(nèi)注射入5只清潔級新西蘭兔的背部,觀察其皮膚改變情況。4.免疫毒性實驗將80只大鼠隨機分為低、中、高劑量組和對照組,腹腔給藥2周,每周2次,恢復周期14天,檢測大鼠血清免疫學指標后進行比較。取大鼠股骨骨髓組織,用吉姆薩染液染色后觀察骨髓涂片。研究結果:hbc浸提液注入sd大鼠體內(nèi)一周后未引起大鼠死亡及不適,急性毒性實驗結果為陰性。將hbc浸提液注射入新西蘭兔體內(nèi)未引起實驗動物體溫升高,致熱原實驗結果為陰性。將hbc浸提液注射入新西蘭兔背部皮膚,實驗組皮膚刺激反應與陰性生理鹽水組相似,無明顯皮膚顏色改變,而與陽性對照組有顯著性差異。血清免疫學實驗中發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白iga、igg、補體c3、殺傷型(cd3+cd8+)t細胞等檢測指標有統(tǒng)計學差異(p值0.05),其余免疫球蛋白igm、補體c4、cd3+t細胞、輔助型(cd3+cd4+)t細胞等檢測指標無統(tǒng)計學差異。說明:羥丁基殼聚糖hbc注入sd大鼠體內(nèi)后,提高了大鼠機體免疫力。骨髓涂片結果:三組(低劑量組、中劑量組、高劑量組)大鼠的骨髓涂片和對照組無顯著差別,恢復期、無恢復期均未見明顯的骨髓增生活躍或骨髓抑制現(xiàn)象。結論:HBC水凝膠動物實驗中表現(xiàn)出較好的生物相容性,可增加大鼠機體免疫力,有望成為一種理想的醫(yī)用生物材料。
[Abstract]:The purpose of the study on the biological safety of the first part of the temperature-sensitive hydroxybutyl chitosan is to prepare the chitosan derivative-hydroxybutyl chitosan (HBC) hydrogel with temperature-sensitive properties for the first time in China. Through the study of the effect of the material on the growth of fibroblasts and vascular endothelial cells in vitro, the cytological behavior of the material was discussed, and the cytological experimental basis was provided for the final clinical application of the material. Study methods:1. The effect of HBC extract on the mouse fibroblast (L929) was at 37 鈩，

本文編號：2501661