【摘要】：骨髓炎是骨關(guān)節(jié)外科手術(shù)后的一種常見的感染性并發(fā)癥,嚴(yán)重的可能導(dǎo)致截肢甚至患者死亡。骨髓炎由于涉及到持續(xù)性的細(xì)菌感染,因此治療極為困難,往往需要經(jīng)過多次外科手術(shù),并聯(lián)合局部或全身的抗生素治療。骨髓炎的常見致病菌為金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌。由于骨骼存在特殊的內(nèi)部環(huán)境,抗生素很難在其內(nèi)部達(dá)到有效的抑菌濃度,而且在特定的情況下,細(xì)菌可以形成這對細(xì)菌具有很強(qiáng)的保護(hù)作用的生物膜,且耐藥信息可以輕易地傳遞并在細(xì)菌之間交換。其結(jié)果是,骨髓炎中的細(xì)菌與浮游細(xì)菌相比較總是具有很強(qiáng)的耐藥性。因此,尋求有效的治療骨髓炎的新型給藥系統(tǒng)亟待解決。 β-磷酸三鈣(β-TCP)作為一種骨替代材料,具有良好的生物相容性,目前被作為可降解支架材料廣泛使用。此外,β-TCP還具有誘導(dǎo)骨形成的能力。由于具有生物可降解性,并含有多孔,聚磷酸鈣支架可以作為抗生素載體用于治療細(xì)菌相關(guān)的骨髓炎。它們可能會使抗菌藥物在局部高效釋放,并避免被清除。此外,在它生物降解的同時引起的抗生素二次釋放,使它負(fù)載的抗生素與不可生物降解的載體相比,可能會會更加有效。 脂質(zhì)體是一種具有生物相容性和生物可降解兩種特性的藥物載體,可以持續(xù)而有針對性的遞送包括抗生素等各種藥物。它可以修飾藥物的生物藥理特性,如改變藥物的吸收及分布。脂質(zhì)體已被證明是對提高抗生素的功效并降低其不良反應(yīng)的有效途徑。此外,已有研究表明脂質(zhì)體在治療細(xì)菌生物膜相關(guān)性感染具有一定優(yōu)勢。目前脂質(zhì)體在針對應(yīng)用抗生素治療細(xì)菌生物膜相關(guān)感染中被廣泛研究和應(yīng)用。 硫酸慶大霉素(GS)是一種氨基糖苷類抗生素,并且是一種治療由革蘭氏陽性菌引起的骨髓炎的有效藥物。氨基糖苷類抗生素的療效取決于它們是否在治療部位達(dá)到其有效的抑菌濃度,而高劑量的氨基糖苷類藥物又會帶來藥物毒性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,采用脂質(zhì)體包被GS是一個有希望的抗菌策略,可由此在感染部位增加抗生素的濃度、延長藥物釋放時間,并且可以有效地降低藥物的毒性反應(yīng)。 基于以上分析,本研究擬制備負(fù)載GS的脂質(zhì)體,將其與β-TCP支架(LCS)復(fù)合,研究其在體外的釋藥特性,并對其在體外的抑制生物膜活性進(jìn)行研究,以期為臨床治療頑固性骨髓炎提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究分為三個部分進(jìn)行： (1)硫酸慶大霉素脂質(zhì)體的制備及其質(zhì)量評價(jià)。 (2)GS脂質(zhì)體復(fù)合多孔β-TCP支架(LCS)的制備及體外釋藥研究。 (3)GS脂質(zhì)體復(fù)合多孔β-TCP支架體外評估抗生物膜活性。 主要研究方法： 1.GS脂質(zhì)體的制備及包封率測定； 將DPPC和膽固醇以3：1的摩爾比混合后溶解在甲醇和氯仿(體積比1：4)組成的混合溶劑。將脂溶液置于圓底燒瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40℃、減壓條件下干燥以形成干燥的脂質(zhì)膜；脂膜在真空中進(jìn)行12小時干燥；此后,脂質(zhì)膜與2%(重量/積)的GS溶液在55℃下磁力攪拌形成均勻的懸浮液。將懸浮液用探針型超聲波儀,在不同的超聲處理功率和時間下均化和減小粒徑；然后在60000g,4℃下進(jìn)行離心2h,分離未包封的GS；將沉淀物重新懸浮在適量去離子水；脂質(zhì)體的包封率(EE)的計(jì)算通過使用AXSYM系統(tǒng)測定在超速離心后的上清液中的未包封GS濃度,并與添加到該制劑中的初始GS量比較。制備GS脂質(zhì)體的粒徑用Nano-ZS zeta粒度儀在25℃下條件分三組進(jìn)行分析。 2.GS脂質(zhì)體復(fù)合β-TCP支架(LCS)的制備 醫(yī)療級β-TCP支架(0.5毫米顆粒)稱重后浸入GS脂質(zhì)體樣品中,在浴式超聲儀超聲處理20min,然后將壓力降至0.09兆帕后繼續(xù)處理20分鐘,以使脂質(zhì)體充分滲入多孔支架。隨后,將樣品轉(zhuǎn)移至玻璃瓶并冷凍干燥。將顆粒放入1%的Triton X-100溶液中研磨,然后超聲處理10分鐘以完全釋放脂質(zhì)體GS。將所得懸浮液在4000rpm離心10分鐘,并通過AXSYM系統(tǒng)對上清液中的GS含量進(jìn)行測定。 3.掃瞄電鏡觀察支架形態(tài) 將凍干的支架截?cái)?然后連接到到金屬底座并在真空下鍍金。掃描電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。 4.體外釋放研究 將0.2克顆粒加入含有1.0毫升PBS溶液(pH7.4)的EP管中,在37℃,30轉(zhuǎn)條件下振蕩水浴。定時取出釋放介質(zhì),并加入等體積新鮮培養(yǎng)基。取出的培養(yǎng)基在60000g和4℃下進(jìn)行超速離心2小時。上清液中的GS含量通過AXSYM系統(tǒng)進(jìn)行分析。沉淀物中加入1.0ml1%的Triton X-100溶液,超聲處理10分鐘將脂質(zhì)體裂解后對GS含量進(jìn)行分析。 5.細(xì)菌生物膜的準(zhǔn)備 將金黃色葡萄球菌接種到血瓊脂平板。37℃孵育過夜,然后將細(xì)菌從固體瓊脂平板轉(zhuǎn)移至含有營養(yǎng)肉湯和酵母提取物的離心管中,離心管在恒溫振蕩器在37℃過夜,然后將試管以2000rpm離心10分鐘,除去上清。將沉淀溶于20mL無菌PBS。上述過程重復(fù)三次。細(xì)菌懸浮液用PBS稀釋至OD值為5.5(吸光值為550nm處)。然后將細(xì)菌懸浮液以每孔200μL接種到96孔平底微量滴定板并在室溫下孵育18小時。在使用前除去上清液并將孔用PBS洗滌三次。 6.脂質(zhì)體聯(lián)合β-TCP支架抗生物膜活性評價(jià) 體外釋放一定間隔如前所述,收集釋放介質(zhì),超速離心,再懸浮,以形成適當(dāng)?shù)臐舛?形成生物膜的孔中每孔加入200μL,時間1小時,然后除去。對照組用GS水溶液和空白PBS分別在相同的總體藥物濃度下處理。1h后將孔用PBS洗滌三次以除去游離的藥物和細(xì)菌,然后加入培養(yǎng)基至550nm處的OD值為0.1。然后每隔30分鐘測定一次在630nm處的OD值,總時間為24小時,記錄OD值達(dá)到0.5的時間。 7.激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)菌生物膜的形成 采用6孔板培養(yǎng)細(xì)菌,在蓋玻片上形成生物膜,24小時后分別用GS脂質(zhì)體復(fù)合β-TCP支架、游離慶大霉素及PBS干預(yù),培養(yǎng)48小時后取出玻片,采用FITC-ConA及PI染色,激光共聚焦顯微鏡(CLSM)下觀察生物膜形成的情況。 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)是每個樣品一式三份,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析(ANOVA)分析,用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0進(jìn)行分析。p值0.05為有顯著性差異。 主要結(jié)果 1.GS脂質(zhì)體的特性 制備了從100nm到5μm的粒徑的脂質(zhì)體,與β-TCP支架材料復(fù)合。不同超聲處理?xiàng)l件下可以得到不同粒徑的脂質(zhì)體。當(dāng)超聲處理功率升高或超聲處理時間延長,脂質(zhì)體的平均粒徑縮小。脂質(zhì)體的包封率隨粒徑的降低而降低(LCS1～5)。 2.LCS的特性 硫酸慶大霉素脂質(zhì)體復(fù)合前后的支架掃描電鏡顯示在復(fù)合前,β-TCP支架有一個相對平滑的表面,其微孔直徑約100微米；在與硫酸慶大霉素脂質(zhì)體復(fù)合后,可見脂質(zhì)體顆粒被吸附于支架的表面上。 復(fù)合于β-TCP支架材料的脂質(zhì)體具有不同的粒徑。該GS脂質(zhì)體配方GL1～5對應(yīng)于不同粒徑分別用LCS1～5表示。GS含量在LCS3的情況下達(dá)到最高水平,約7.05毫克/克,在LCS1的情況下為GS最低水平,約4.95毫克/克。LCS3和LCS2中脂質(zhì)體的含量最高,分別是162.07毫克/克和160.49毫克/克,兩組之間無顯著性差異(p0.1)；當(dāng)脂質(zhì)體粒徑從5μm減小到800nm,該脂質(zhì)體復(fù)合效率提高. 3.在體外GS從LCS釋放 硫酸慶大霉素主要以脂質(zhì)體的形式從β-TCP支架中釋放。24小時之內(nèi),游離的硫酸慶大霉素累積釋放只有約5%。對樣品的釋放結(jié)果分別進(jìn)行一級釋藥方程、Higuchi平面擴(kuò)散模式方程以及Ritger-Peppas方程模擬,表明在初始的第1小時不同制劑的釋放曲線是類似的,都是一個快速釋放模式。隨后釋放減速,各組間出出現(xiàn)差異,釋放常數(shù)k隨著脂質(zhì)體的粒徑的增加呈下降趨勢。此外,釋放常數(shù)k的趨勢呈現(xiàn)多元化,在0.5～2小時的間隔,5種不同粒徑的脂質(zhì)體復(fù)合的LCS支架的釋放常數(shù)k比較相似,其中LCS2和3超過0.50的限制值。 4.抗生物膜活性評價(jià) 采用FITC-ConA標(biāo)記生物膜基質(zhì)中的多糖,用碘化丙啶(PI)標(biāo)記生物膜中的細(xì)菌,借助激光掃描共聚焦顯微鏡觀察生物膜的水平斷層圖像。結(jié)果顯示與對照組相比,硫酸慶大霉素脂質(zhì)體復(fù)合的支架能夠顯著抑制生物膜結(jié)構(gòu)的形成并能有效殺死其內(nèi)定植的細(xì)菌。 為了模擬從LCS中的脂質(zhì)體釋放GS的不同階段,抗生物膜活性研究中將GS的含量范圍設(shè)定為從2.5μg/mL到800μg/mL的不同濃度,并與相同濃度單純GS組相比較。結(jié)果顯示即使是在最低濃度,與對照組相比,LCS組仍然顯示出較好的抗生物膜活性(p0.01)。 結(jié)論 我們制備的硫酸慶大霉素脂質(zhì)體通過不同的超聲處理得到了不同粒度的GS脂質(zhì)體,并將其成功的復(fù)合于多孔β-TCP支架中。掃描電鏡觀察確認(rèn)其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)體的結(jié)合率足夠高,可以提供藥物的有效遞送。在起始階段,從LCS中的藥物是以脂質(zhì)體的形式釋放,然后再釋道出游離的GS,這種釋放方式是用于治療和預(yù)防術(shù)后骨髓炎的一種理想釋放模式；在抗細(xì)菌生物膜的研究中,與游離的GS相比,GSLCS顯示出顯著的抗生物膜活性,同時,其抗生膜活性也與脂質(zhì)體的粒徑相關(guān)。我們的研究表明,硫酸慶大霉素脂質(zhì)體復(fù)合的β-TCP支架可能是一種用于治療骨髓炎的有效策略。但其在體內(nèi)的藥物釋放及效果評價(jià)有待于進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R687;R318.08

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本文編號：2476336