【摘要】：納米科技作為新興的前沿科技領(lǐng)域,正在深化和改變著人類對客觀世界的認(rèn)知,也將引發(fā)一場新的工業(yè)革命,從而對經(jīng)濟(jì)社會未來的發(fā)展產(chǎn)生重要影響。納米技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于多個領(lǐng)域,在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域,納米技術(shù)對疾病特別是重大疾病的早期診斷和治療將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。人體接觸納米材料途徑包括了吸入接觸,皮膚接觸,吞咽接觸和眼睛接觸。人體上皮細(xì)胞覆蓋身體外表面和內(nèi)部器官外表面,納米材料接觸人體后首先接觸上皮細(xì)胞。細(xì)胞面對外界壓力時(shí),其細(xì)胞內(nèi)的壓力反饋機(jī)制即被觸發(fā)。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變在反饋外界壓力時(shí)扮演著重要角色,組蛋白修飾調(diào)控快速靈活且不改變DNA序列,具有可逆性,介導(dǎo)了常染色質(zhì)和異染色質(zhì)之間的動態(tài)轉(zhuǎn)換,使相關(guān)的壓力反應(yīng)基因快速激活或者沉默,執(zhí)行細(xì)胞中的生存或者死亡功能,保證個體的健康。雖然納米生物效應(yīng)與安全性已經(jīng)有了大量的研究,但是由于其機(jī)制復(fù)雜,評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)各異,因此仍需要進(jìn)一步的研究,尤其是對涉及到染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的納米材料壓力反應(yīng)的研究,該研究可以成為納米毒性評估的重要手段。本論文以正常上皮細(xì)胞和癌上皮細(xì)胞為材料,研究納米材料誘導(dǎo)正常和癌上皮細(xì)胞中表現(xiàn)出不同的核仁紊亂的分子機(jī)制和組蛋白修飾調(diào)控,以及誘導(dǎo)正常上皮細(xì)胞周期阻滯和凋亡的分子機(jī)制和組蛋白修飾調(diào)控。主要內(nèi)容如下：1.納米材料誘導(dǎo)的不同的核仁紊亂取決于上皮細(xì)胞的癌變我們研究了納米材料的組成,尺寸和毒性離子的溶解率對細(xì)胞存活率的影響。納米材料包括碳納米管(SWCNT, MWCNT 8 nm和MWCNT 50 nm)和金屬氧化物納米材料(TIO, NPs和ZnO NPs),細(xì)胞包括人類正常(HaCaT)和癌(A549)上皮細(xì)胞系。細(xì)胞存活率試驗(yàn)表明在暴露到1000μg/mL ZnO NPs后,相較對照,HaCaT細(xì)胞和A549細(xì)胞的存活率分別降到22.7%和38.8%,同樣濃度的TIO2 NPs對被檢測的細(xì)胞基本上沒影響。1000μ g/mL MWCNT 8 nm處理之后,HaCaT細(xì)胞和A549細(xì)胞存活率分別降低16.2%和30.0%,但1000μ g/mL MWCNT 50 nm處理后,HaCaT細(xì)胞存活率降低10%,而A549細(xì)胞基本不受影響,SWCNT對細(xì)胞活性影響較小。這些結(jié)果表明,釋放毒性離子和較小尺寸的納米材料表現(xiàn)出更高的細(xì)胞毒性,細(xì)胞毒性被材料的性質(zhì),濃度和細(xì)胞類型共同決定。當(dāng)細(xì)胞暴露在納米材料中,其細(xì)胞活性被蛋白對材料的吸附性以及材料與蛋白的相互作用所影響,因此我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測了正常和癌上皮細(xì)胞中納米材料的攝入。我們發(fā)現(xiàn)不同的納米材料對于不同的細(xì)胞攝入有著差異影響,尤其是金屬納米氧化物TiO2NPs和ZnO NPs暴露后,其攝入表現(xiàn)出明顯的增加。細(xì)胞面對外界壓力的反應(yīng)和整體的組蛋白甲基化和去甲基化相關(guān),H3K9me2是細(xì)胞核上異染色質(zhì)的標(biāo)志。我們用免疫染色檢測了納米材料誘導(dǎo)的常染色質(zhì)和異染色質(zhì)之間的動態(tài)變化,結(jié)果顯示H3K9me2信號在3小時(shí)的納米材料暴露后就已經(jīng)強(qiáng)烈增加,但此時(shí)納米材料的細(xì)胞攝入和表面吸附相較于24小時(shí)并不明顯,表明常染色質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)楫惾旧|(zhì)發(fā)生在納米材料暴露的早期。隨后我們用H3K9me2和H3K9ac信號定量分析了這兩種染色質(zhì)狀態(tài)的改變。核仁周圍的異染色質(zhì)能夠保護(hù)核仁結(jié)構(gòu)和rDNA穩(wěn)定性,核仁作為壓力反應(yīng)器可以通過調(diào)控核仁中rDNA的RNA聚合酶Ⅰ的轉(zhuǎn)錄和rRNA的剪接,來保持細(xì)胞內(nèi)的能量穩(wěn)定。定量PCR結(jié)果顯示,和對照組相比,納米材料誘導(dǎo)正常上皮細(xì)胞45S rRNA前體表達(dá)降低,SWCNT降至1.60%, MWCNT8 nm降至50%,MWCNT 50 nm降至18%, TIO2 NPs降至10%, ZnO NPs降至49%。和對照組相比,癌上皮細(xì)胞45S rRNA前體表達(dá)增高,SWCNT升高194.8倍,MWCNT 8 nm升高227.9倍,MWCNT 50 nm升高241.8倍,ZnO NPs升高18.3倍。表明面對納米材料的壓力,正常上皮細(xì)胞和癌上皮細(xì)胞的45S rRNA前體轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制不一致。隨后我們做了45S rDNA區(qū)域內(nèi)的的H3K9ac, H4K5ac, H3K9me2, H3K27me2和H3K4me2組蛋白修飾的ChIP試驗(yàn),結(jié)果顯示H3K9ac,H4K5ac和H3K9me2組蛋白修飾在可能主要參與納米材料暴露后正常上皮細(xì)胞和癌上皮細(xì)胞45S rRNA前體表達(dá)的差異改變,H3K4me2和H3K27me2可能在不同組蛋白修飾的相互影響中,部分的參與了45S rRNA前體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。2.納米氧化鋅顆粒誘導(dǎo)人表皮角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞凋亡及分子遺傳機(jī)理我們從表觀和分子的水平,以人源永生化表皮角質(zhì)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?系統(tǒng)的研究了氧化鋅納米顆粒(ZnO NPs)對細(xì)胞的影響。在細(xì)胞活力受到抑制之前,ZnO NPs對細(xì)胞的處理使細(xì)胞周期在G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)處阻滯,這個過程還伴隨著表觀遺傳修飾的變化,并且和隨后發(fā)生的細(xì)胞凋亡反應(yīng)相關(guān)。在24小時(shí)內(nèi),核染色質(zhì)發(fā)生凝縮,并伴隨著組蛋白H3K9甲基化水平上升,組蛋白H4K5乙�；较陆�。與此同時(shí),甲基轉(zhuǎn)移酶基因G9a和GLP的表達(dá)量上升,乙酰轉(zhuǎn)移酶基因GCN5, P300和CBP表達(dá)量下降。在ZnO NPs處理細(xì)胞6小時(shí)的過程中,細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平顯著提升,24小時(shí)后觀察到了DNA損傷的現(xiàn)象。透射電子顯微鏡和流式細(xì)胞檢測證實(shí)培養(yǎng)基內(nèi)添加的氧化鋅納米顆粒進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部,并在24小時(shí)后通過掃描電子顯微鏡觀察到凋亡小體的產(chǎn)生,流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)氧化鋅納米顆粒引起了細(xì)胞的凋亡。在氧化鋅納米顆粒作用24小時(shí)后,p53-Bax線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中的凋亡基因Bax, Noxa和Puma的表達(dá)量被發(fā)現(xiàn)顯著上升,而抗凋亡基因Bcl-xl顯著下調(diào)。綜上我們總結(jié)出ZnO NPs可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期的G2/M阻滯,這個過程與p53-Bax線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑相關(guān),并伴隨著表觀遺傳修飾的變化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;TB383.1

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