【摘要】：RNA干擾(RNAi)在針對腫瘤、病毒感染和糖尿病等疾病的治療中具有非常大的應(yīng)用潛力。雖然RNAi的作用原理已經(jīng)明晰,但是能夠有效遞送siRNA的載體十分有限,因而極大地限制了RNAi的臨床應(yīng)用。盡管基于病毒載體的RNAi在具有靶向性的同時顯示出高轉(zhuǎn)染效率,但病毒的應(yīng)用可能引起潛在的突變,也有可能帶來免疫原性等問題。納米材料是一類典型的非病毒載體,具有小尺寸、易修飾等優(yōu)點,而且能夠有效地攜帶siRNA進入細(xì)胞并誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)。但是,納米毒理學(xué)的研究結(jié)果表明,各種納米材料均有不同程度的細(xì)胞毒性。因此,研究納米材料與siRNA的結(jié)合,以及與細(xì)胞之間的相互作用,例如細(xì)胞攝入、定位和轉(zhuǎn)歸等,可以為設(shè)計更安全和高效的siRNA遞送載體提供理論依據(jù)。本研究以金納米棒(AuNRs)和合成高分子普魯蘭精胺(Ps)多糖作為siRNA載體,研究它們對乳腺癌細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)水平的影響,同時分析和探討上述載體與細(xì)胞之間的相互作用。取得了如下主要研究結(jié)果： 1.電子顯微鏡觀察結(jié)果表明,AuNRs可以通過內(nèi)吞途徑進入乳腺癌腫瘤細(xì)胞,然后進入到溶酶體成熟途徑,最終以聚集體的形式定位在殘余小體中。位于這些囊泡結(jié)構(gòu)中的AuNRs可以通過外排的方式被排出；但是,在靜態(tài)培養(yǎng)條件下,外排的AuNRs可以再次被內(nèi)吞而重新進入細(xì)胞。只有極少量AuNRs可以從溶酶體逃逸到細(xì)胞質(zhì)中,但是,細(xì)胞的保護性自噬可以將其重新限制在溶酶體結(jié)構(gòu)中。細(xì)胞內(nèi)的AuNRs主要依靠細(xì)胞分裂而得以稀釋。上述過程保證了細(xì)胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等重要細(xì)胞器不會直接接觸到AuNRs,由此闡釋了AuNRs的良好生物相容性。 2.為了對細(xì)胞內(nèi)的AuNRs進行定量表征,建立了一種基于紫外—可見—近紅外(UV-Vis-NIR)吸收光譜的定量分析方法,可對進入乳腺癌細(xì)胞中的AuNRs進行實時分析。與電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)方法相比,該方法可以實現(xiàn)對活細(xì)胞內(nèi)的AuNRs進行定量,并分析AuNRs在細(xì)胞內(nèi)的分散狀態(tài),且操作簡單,價格低廉。 3.研究結(jié)果表明,表面帶有正電荷的AuNRs作為PAR-1siRNA的載體,可以顯著下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中PAR-1蛋白的表達(dá),有效抑制了細(xì)胞的遷移能力。與此同時,細(xì)胞毒性實驗結(jié)果表明,與商業(yè)化載體lipofectamine2000和TurboFect相比,AuNRs具有良好的生物相容性。上述結(jié)果提示,AuNRs結(jié)合PAR-1siRNA可以作為一種抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的策略。 4.以精胺化多糖(Ps)作為siRNA載體,系統(tǒng)研究了培養(yǎng)基中血清含量對普魯蘭精胺與siRNA復(fù)合物顆粒(Ps-siRNA)尺寸的影響,分析了這種影響與RNAi干擾效率之間的關(guān)系。結(jié)果表明,Ps-siRNA在低血清條件下發(fā)生聚集,形成微米尺度的聚集體,經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)吞而定位于溶酶體中,使單個溶酶體內(nèi)有更多的亞氨基,從而引起更強的質(zhì)子海綿效應(yīng),導(dǎo)致溶酶體腫脹,有利于siRNA分子從溶酶體逃逸,獲得較高的干擾效率。但是在低血清條件下Ps-siRNA的聚集也導(dǎo)致了更高的細(xì)胞毒性。這可能是由于Ps-siRNA聚集體沉降至細(xì)胞表面后引起細(xì)胞膜的損傷而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。在高血清條件下,Ps-siRNA的分散性良好但是溶酶體逃逸能力低,從而介導(dǎo)的RNAi效應(yīng)也弱。但是高血清條件下Ps-siRNA的良好分散性可以有效降低其相應(yīng)的細(xì)胞毒性。在氯喹的后處理作用下,可以大幅度地提高Ps-siRNA在高血清條件下的RNAi效率。上述結(jié)果說明,可以通過調(diào)控培養(yǎng)基內(nèi)血清的含量來平衡干擾效率和細(xì)胞毒性。 綜上所述,本文的研究結(jié)果為研發(fā)新型siRNA載體、提高RNAi效率和降低載體的細(xì)胞毒性提供了理論依據(jù)和基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2422200