【摘要】：腫瘤切除、創(chuàng)傷和先天性畸形是臨床上導(dǎo)致骨和軟骨缺損的主要原因。目前,修復(fù)骨及軟骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)是自體組織移植,但自體組織移植會給患者帶來二次創(chuàng)傷,而且取材量有限,因此,骨和軟骨缺損修復(fù)依然是醫(yī)學(xué)界的難點。組織工程(tissue engineering, TE)技術(shù)為骨和軟骨組織缺損修復(fù)提供了有效的方法。TE的基本原理是從機(jī)體內(nèi)獲得少量的細(xì)胞(又稱種子細(xì)胞)在體外培養(yǎng)擴(kuò)增,然后使擴(kuò)增的細(xì)胞粘附在生物材料上形成細(xì)胞-材料復(fù)合物,將該復(fù)合物植入機(jī)體的組織或器官病損部位,修復(fù)創(chuàng)傷。TE的基本要素包括種子細(xì)胞,促進(jìn)細(xì)胞和組織再生的生物活性分子,以及用以維持人工組織特定形態(tài)的支架材料。理想的組織工程支架材料應(yīng)滿足：①易于成型；②適當(dāng)?shù)牧W(xué)性能；③適宜的降解速率；④無免疫原性,不引起免疫排斥反應(yīng)及炎癥；⑤生物相容性好,利于組織修復(fù)、生長等。近年來,出現(xiàn)了靜電紡絲高分子材料用于骨及軟骨組織工程,其優(yōu)點是構(gòu)建了類似于細(xì)胞外基質(zhì)的微米或納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),但材料孔徑較小,不利于細(xì)胞進(jìn)入材料內(nèi)部從而限制了組織向內(nèi)生長。近十年出現(xiàn)的還有水凝膠材料,其可以方便實現(xiàn)細(xì)胞的包埋,但其生物惰性和不可降解性以及難以塑形性限制了它的應(yīng)用。最新出現(xiàn)的還有3D打印組織技術(shù),然而種子細(xì)胞在應(yīng)用該技術(shù)制備的組織工程材料中的存活率較低。結(jié)合組織工程支架材料的研究現(xiàn)狀,本論文探究制備了新型組織工程骨及軟骨支架材料,并對其性能進(jìn)行了系統(tǒng)評價。本論文選取了天然蠶絲作為基底材料,它具有優(yōu)良的力學(xué)性能,一定的降解速率,無免疫原性等特點。但天然蠶絲缺乏促進(jìn)細(xì)胞粘附和生長的生物活性成分,因此本論文通過基因工程技術(shù),發(fā)酵獲得類彈性蛋白(elastin-like polypeptide, ELP),用ELP修飾蠶絲纖維材料表面。為了提高支架材料的力學(xué)性能及穩(wěn)定性,應(yīng)用低溫冷凍干燥、干熱交聯(lián)、京尼平交聯(lián)、原花青素交聯(lián)和戊二醛／聚乙二醇交聯(lián)五種方法制備五種類彈性蛋白-蠶絲復(fù)合材料支架。并通過掃描電子顯微鏡、力學(xué)測試分析和細(xì)胞相容性實驗對五種方法制備的類彈性蛋白-蠶絲復(fù)合支架進(jìn)行比較篩選,最終選出了力學(xué)性能和細(xì)胞相容性較好的干熱交聯(lián)類彈性蛋白-蠶絲復(fù)合支架(silk-elastin like polypeptide-dehydrothermal treatment, S-ELP-DHT)。采用紅外光譜、掃描電鏡、水接觸角測試、蛋白損失速率測試、材料體外降解速率測試和力學(xué)性能測試系統(tǒng)檢測了干熱交聯(lián)彈性蛋白-蠶絲復(fù)合支架的理化性質(zhì)及其穩(wěn)定性。結(jié)果表明：①干熱處理并未破壞類彈性蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)。②干熱交聯(lián)類彈性蛋白-蠶絲復(fù)合支架具有三維多孔結(jié)構(gòu),孔隙率達(dá)到85%以上,且孔隙間形成多孔薄膜,為細(xì)胞粘附和生長提供了更多空間。③干熱交聯(lián)類彈性蛋白-蠶絲復(fù)合支架彈性模量顯著提高,更易于加工成型。④干熱交聯(lián)復(fù)合材料在模擬體液中降解2個月后,質(zhì)量仍保持在初始質(zhì)量的61%以上,基本與軟骨或骨修復(fù)速率相匹配。通過觀察、測試骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分別在熱交聯(lián)類彈性蛋白-蠶絲復(fù)合材料上的粘附、增殖、分化等行為來評價該材料的細(xì)胞相容性。①細(xì)胞粘附實驗和細(xì)胞接種效率測試實驗結(jié)果證明：干熱交聯(lián)類彈性蛋白-蠶絲復(fù)合支架上粘附的細(xì)胞(MSCs和軟骨細(xì)胞)形態(tài)良好,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的接種效率可達(dá)到79%以上軟骨細(xì)胞接種效率可達(dá)到74%以上。②細(xì)胞增殖實驗結(jié)果證明：干熱交聯(lián)類彈性蛋白-蠶絲復(fù)合支架上細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng),細(xì)胞增長速度顯著高于二維的類彈性蛋白材料上細(xì)胞的增長速度。③細(xì)胞分化實驗結(jié)果證明：干熱交聯(lián)類彈性蛋白-蠶絲復(fù)合支架利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。干熱交聯(lián)類彈性蛋白-蠶絲復(fù)合支架能促進(jìn)軟骨細(xì)胞中軟骨標(biāo)志基因Col Ⅱ和AGG的表達(dá),利于軟骨細(xì)胞維持軟骨表型。將S-ELP-DHT/細(xì)胞復(fù)合物植入裸鼠皮下,評價干熱交聯(lián)類彈性蛋白-蠶絲復(fù)合材料的組織相容性、異位成骨能力和異位成軟骨能力。結(jié)果證實：①干熱交聯(lián)彈性蛋白-蠶絲復(fù)合支架無免疫原性,組織相容性好。②干熱交聯(lián)彈性蛋白-蠶絲復(fù)合支架材料在動物體內(nèi)降解緩慢,在植入2個月后仍能維持三維多孔結(jié)構(gòu),持續(xù)穩(wěn)定地為細(xì)胞和組織生長提供支撐。③通過大體觀察、顯微CT、組織學(xué)染色、免疫組化和免疫熒光等方法分析植入裸鼠皮下2個月后的S-ELP-DHT/MSCs復(fù)合物,證實該復(fù)合物已異位成骨,且成骨方式為軟骨內(nèi)成骨。④通過大體觀察、力學(xué)測試、GAG含量檢測、組織學(xué)染色、免疫熒光等方法分析植入裸鼠皮下2個月后的S-ELP-DHT/軟骨細(xì)胞復(fù)合物,證實該復(fù)合物已異位成軟骨,且所形成軟骨的結(jié)構(gòu)和功能與纖維軟骨相似,而不同于彈性軟骨和透明軟骨。綜上所述,本論文研究制備出了類彈性蛋白-蠶絲纖維新型三維多孔復(fù)合材料,具備骨及軟骨修復(fù)所需的理化性能、細(xì)胞相容性,同時可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌胞外基質(zhì),維持軟骨形態(tài)。且構(gòu)建的S-ELP-DHT/細(xì)胞復(fù)合物成功在裸鼠皮下異位成骨和異位成軟骨,所形成的骨及軟骨非常接近天然骨和天然軟骨,具有應(yīng)用于骨及軟骨缺損修復(fù)的潛力。
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【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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1 周愛梅;張靜;唐啟偉;葛文浩;胡利;楊樹林;;膠原三維多孔基質(zhì)常用交聯(lián)方法[J];明膠科學(xué)與技術(shù);2014年02期

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本文編號：2417737