【摘要】：作為體外組織構(gòu)建和體內(nèi)組織修復和再生的重要替代物,細胞與三維支架材料的復合體之間的相互作用己成為組織工程研究中的一個非常重要課題。三維支架為細胞的生存和生長構(gòu)建了一個微環(huán)境,它應具有適宜的孔徑、孔隙率、良好的孔連通性和適宜的機械性能。三維支架的結(jié)構(gòu)及表面拓撲形貌等物理因素及化學組成在微納級尺度上的差異都影響著細胞的粘附、增殖、遷移、分化、基因表達等,從而決定著特定組織或器官的形成。三維支架種類包括多孔支架、水凝膠、纖維支架、微球型支架等多種形式,其中微球堆積型支架因其具有較大的比表面積而更利于細胞的增殖和保持表型而備受關注。三維支架的制備方法眾多,其中致孔劑法因其可獲得適宜細胞粘附和增殖的可控孔徑和孔隙率的支架而成為制備微球堆積型支架的首選。本課題以明膠無規(guī)粒子為致孔劑,結(jié)合相分離的原理制備了具有不同表面形貌的聚己內(nèi)酯多孔支架和不對稱粒子,考察了溶液的初始溫度、濃度、粗化溫度、粗化時間和溶劑組成對多孔支架和微球形貌的影響并討論了形成相應結(jié)構(gòu)的機理。當聚己內(nèi)酯／四氫呋喃溶液的初始溫度固定為25℃,在-20℃冰箱中時,液一液相分離起主導作用,得到聚己內(nèi)酯多孔支架,當溶液的初始溫度固定為37℃時,固一液相分離起主導作用,得到不對稱的粒子,明膠模板為不對稱粒子的形成提供了微環(huán)境和成核中心。當體系在-198℃進行粗化時,則全部形成支架。因此,溶液的初始溫度和粗化溫度對支架的最終形貌起著決定性作用�；谥驴讋┓ㄖ苽湮⑶蛑Ъ艿倪^程復雜、冗長、繁瑣等缺點,利用相分離技術(shù)的原理,通過一步凍干法制備了具有大孔結(jié)構(gòu)且孔間連通性良好的聚己內(nèi)酯微球堆積型多孔支架,極大地簡化了制備工藝,并系統(tǒng)研究了溶液初始溫度、濃度等制備參數(shù)對微球堆積型支架形貌、支架上微球的尺寸,孔徑及孔隙率的影響,探討了形成大孔和微球堆積的雙連續(xù)結(jié)構(gòu)的機理。該微球堆積型支架較傳統(tǒng)的多孔支架具有更高的力學性能,有望做為承重的病損組織的修復。微球堆積型支架較傳統(tǒng)的致孔劑法制備的支架更有利于骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和表型保持,糖胺聚糖(GAGs)、堿性磷酸酶(ALP)及Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原檢測結(jié)果表明微球堆積型支架有利于骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化,而傳統(tǒng)的石蠟致孔劑法制備的支架更有利于骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。分化趨勢的不同歸因于支架所特有的微球堆積型結(jié)構(gòu)(物理因素)。除了物理因素外,化學因素對干細胞的粘附、增殖及分化等行為亦有著重要影響。利用堿解技術(shù)對微球堆積型支架和傳統(tǒng)的致孔劑法制備的多孔支架進行了表面活化,接枝了促進肝細胞保持表型的活性組分—半乳糖化的殼聚糖(GC,取代度65%)�？疾炝薌C改性后的微球堆積型支架及多孔支架的孔隙率,力學性能和支架上GC的含量和穩(wěn)定性。在同樣的堿解條件下,微球堆積型支架上羧基含量少于多孔支架上,這和微球的晶體結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定有關,不容易被此堿解條件所破壞。堿解后的微球堆積型支架較堿解前會接枝更多的GC,堿解對微球堆積型支架上GC的穩(wěn)定性影響不顯著。堿解后的多孔支架較堿解前接枝GC的量變化不大,堿解后的多孔支架上的GC具有更好的穩(wěn)定性。雖然微球堆積型支架上GC含量遠遠少于多孔支架上的GC含量,骨髓間充質(zhì)干細胞的接種實驗結(jié)果表明,經(jīng)過GC改性的微球堆積型支架上的細胞活性及白蛋白的分泌量遠高于經(jīng)過GC改性的多孔支架。經(jīng)過GC改性的微球堆積型支架較經(jīng)過GC改性的多孔支架及兩種空白支架更有利于干細胞向肝細胞分化,這歸因于微球堆積型支架所特有的結(jié)構(gòu)和形貌的物理因素及GC改性支架的化學因素的協(xié)同作用所致。物理因素和化學因素對干細胞在支架上的增殖及定向分化行為有著協(xié)同作用,利用膠原對微球堆積型支架進行了改性,考察了不同濃度膠原改性的微球堆積型支架的形貌、支架上膠原的含量、孔隙率、力學強度及膠原改性的微球堆積型支架對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的粘附、增殖及分化等行為的影響。膠原改性支架上的細胞活性遠高于空白微球堆積型支架,0.1%膠原改性的微球堆積型支架上的細胞活性始終高于或保持與0.5%、0.3%膠原改性的微球堆積型支架上的細胞活性相當。培養(yǎng)至21天時,0.1%、0.3%、0.5%膠原改性支架上的細胞活性較14天時略有下降,可能的原因是細胞在支架上大量快速生長后導致的細胞凋亡加速。糖胺聚糖及堿性磷酸酶檢測結(jié)果表明,經(jīng)過0.5%膠原改性的微球堆積型支架上細胞分泌的堿性磷酸酶量顯著高于經(jīng)過0.1%膠原改性的和空白的微球堆積型支架上的細胞的分泌量,而糖胺聚糖的分泌量顯著低于經(jīng)過0.1%膠原改性的和空白微球堆積型支架上的細胞的分泌量。經(jīng)過膠原改性的微球堆積型支架有利于支架上的干細胞向成骨細胞分化,濃度越高向成骨細胞分化的趨勢越顯著,此體系中化學因素對干細胞的分化行為起著關鍵作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R318.08;TQ317

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