【摘要】：多糖是生命體內(nèi)一類重要的信息分子,參與許多生理、病理過程,如細(xì)胞識別、信號傳導(dǎo)、炎癥發(fā)生、腫瘤惡化等。一些糖基化蛋白可作為癌癥等疾病的標(biāo)志物用于臨床診斷；細(xì)胞表面糖基(如甘露糖、唾液酸等)表達(dá)量的變化與腫瘤惡化和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；甲型流感病毒表面的糖基在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中扮演著重要的角色。因此,復(fù)雜基質(zhì)生物樣品中糖類化合物的靈敏份析具有重要的意義。近年來,基于元素標(biāo)記的電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)技術(shù)已成為生物分子定量分析中強(qiáng)有力的工具,具有定量方式簡單、靈敏度高、基體干擾小、線性范圍寬以及可實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn),在蛋白質(zhì)、核酸等生物分子檢測以及細(xì)菌、癌細(xì)胞分析等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。然而,目前將元素標(biāo)記IC(?)檢測方法用于糖類化合物分析的報(bào)道還很少,因此有必要開發(fā)新型的元素標(biāo)。ICP-MS方法用于糖類化合物的靈敏分析,以進(jìn)一步拓展其在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用范圍。凝集素和硼酸是兩類經(jīng)典的對糖基具有選擇性識別作用的分子,其對糖基的親和作用將有助于實(shí)現(xiàn)糖類化合物的元素標(biāo)記及ICP-MS檢測。此外,為了滿足生物分析領(lǐng)域中越來越高的對低含量目標(biāo)物的分析要求,將高效的信號放大策略引入元素標(biāo)記技術(shù)中,進(jìn)一步提高基于ICP-MS生物分析方法的靈敏度十分必要。納米金(AuNPs)是一種理想的元素標(biāo)簽,具有生物相容性好、制備和標(biāo)記方法簡單等優(yōu)點(diǎn),并且由于單顆納米粒子中含有成百上千個(gè)金原子,因此在ICP-MS檢測中具有信號增強(qiáng)的作用。雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一類新型的DNA放大技術(shù),具有高效、簡單、無需酶催化和熱循環(huán)等優(yōu)點(diǎn),將其與元素標(biāo)記ICP-MS技術(shù)相結(jié)合有望實(shí)現(xiàn)分析方法靈敏度的進(jìn)一步提高。本論文的研究目的是：開發(fā)基于糖基識別作用的元素標(biāo)記糖類化合物的新方法,發(fā)展新型信號放大策略用于元素標(biāo)記以提高方法的靈敏度,拓展元素標(biāo)記ICP-MS分析方法在生物醫(yī)學(xué)分析中的應(yīng)用。本論文的主要研究內(nèi)容包括：(1)發(fā)展了一種基于硼酸富集的磁免疫-ICP-MS分析新方法用于兩種糖蛋白的同時(shí)定量分析。制備了4-巰基苯硼酸功能化的磁珠,可以從復(fù)雜樣品基質(zhì)中選擇性地捕獲糖蛋白,并分別使用AuNPs和納米銀(AgNPs)標(biāo)記兩種糖蛋白對應(yīng)的抗體用于磁免疫反應(yīng),通過ICP-MS同時(shí)檢測Au和Ag的信號實(shí)現(xiàn)了糖蛋白的靈敏分析。以甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)作為兩種模型糖蛋白用于磁免疫分析,本方法對AFP和CEA的檢出限分別為0.086μgL-1和0.054μL-1,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n一=7,c=5μg L-1)分別為6.5%和6.2%,線性范圍均為0.2-50μgL-1。將本方法用于癌癥病人血清樣本的分析,獲得的結(jié)果與臨床使用的化學(xué)發(fā)光免疫分析的結(jié)果吻合良好。(2)建立了一種基于硼酸識別的AuNPs標(biāo)記ICP-MS分析新方法用于癌細(xì)胞表面唾液酸的分析。合成了一種“生物素化苯硼酸”化合物,利用苯硼酸與唾液酸在生理pH條件下的特異性識別作用使其與細(xì)胞表面唾液酸結(jié)合,并通過AuNPs標(biāo)記的鏈霉親和素與生物素的親和作用,將AuNPs標(biāo)記于細(xì)胞表面作為元素標(biāo)簽,以實(shí)現(xiàn)ICP-MS的高靈敏檢測。以肝癌細(xì)胞(HepG2)和乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)作為兩種模型細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過自由唾液酸競爭實(shí)驗(yàn)得到單個(gè)HepG2和MCF-7細(xì)胞表面唾液酸分子的平均個(gè)數(shù)分別為5.4×109和7.0×109。以唾液酸作為癌細(xì)胞表面標(biāo)志物,本方法對HepG2和MCF-7細(xì)胞的檢出限分別為120和64個(gè)細(xì)胞,線性范圍分別為300-10000和170-11000個(gè)細(xì)胞,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=9,細(xì)胞個(gè)數(shù)為1000)分別為9.6%和8.9%。(3)構(gòu)建了一種基于AuNPs標(biāo)記和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)的雙重放大策略用于元素標(biāo)記,結(jié)合ICP-MS檢測實(shí)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)的靈敏分析。制備了抗上皮細(xì)胞粘附因子抗體(anti-EpCAM)偶聯(lián)的磁珠用于從外周血中選擇性捕獲CTCs,通過HCR得到生物素修飾的DNA串聯(lián)體,并利用鏈霉親和素與生物素的作用將AuNPs標(biāo)記于DNA串聯(lián)體上制備了標(biāo)記探針(AuNPs標(biāo)記的DNA串聯(lián)體),用于目標(biāo)細(xì)胞的元素標(biāo)記和ICP-MS檢測。以肝癌細(xì)胞HepG2作為模型細(xì)胞用于磁免疫分析,本方法對HepG2細(xì)胞的檢出限低至15個(gè)細(xì)胞,線性范圍為40-8000個(gè)細(xì)胞,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=7,細(xì)胞個(gè)數(shù)為200)為8.7%。將所建立的方法用于人血液樣本中HepG2細(xì)胞的加標(biāo)實(shí)驗(yàn),獲得了良好的結(jié)果,表明本方法可用于實(shí)際血樣的分析。(4)建立了一種基于凝集素識別和雙重信號放大策略的元素標(biāo)記ICP-MS分析新方法用于H9N2病毒的靈敏檢測。利用伴刀豆凝集素(Con A)對病毒糖蛋白的親和識別作用實(shí)現(xiàn)了元素標(biāo)記,并通過AuNPs標(biāo)記和HCR的雙重信號放大提高了ICP-MS檢測的靈敏度。制備了抗H9N2病毒血凝素抗體(anti-H9N2 HA)偶聯(lián)的磁珠對復(fù)雜基質(zhì)樣品中的病毒H9N2進(jìn)行選擇性捕獲,并且以Con A為橋梁實(shí)現(xiàn)了含有甘露糖“頭部”的AuNPs標(biāo)記DNA串聯(lián)體對H9N2病毒粒子的標(biāo)記并用于ICP-MS檢測。本方法對H9N2病毒粒子的檢出限為0.12 μg L-1,線性范圍為0.4-50μL-1,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=7,c=2μg L-1)為7.9%。將所建立的方法用于雞糞提取液樣品中H9N2病毒的加標(biāo)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了本方法在實(shí)際樣品分析中的應(yīng)用潛力。
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【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O657.63;R318
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本文編號：2411894