【摘要】：第一部分：基質金屬蛋白酶酶解控釋血管內皮生長因子聚乙二醇水凝膠制備與鑒定 第一節(jié)四枝化狀丙烯�；垡叶嫉暮铣膳c鑒定 目的：運用接枝聚合方法制備四枝化狀丙烯酰化聚乙二醇(4branched-PEG-DA),并鑒定其化學結構及屬性是否符合實驗設計要求。 方法：以分子量20,000Da線性聚乙二醇(PEG)單體為原料,通過四步合成方法,在單體末端引入四個丙烯酰基雙鍵官能團。經紅外光譜、1H核磁波譜、高效液相色譜、基質輔助激光解吸電離及凝膠過濾色譜檢測聚合物產品在分子結構、目標官能團置換度、終產物產率、分子量及產物純度方面是否符合實驗設計、滿足后續(xù)實驗要求。 結果：自制4branched-PEG-DA產物經紅外光譜、1H核磁共振檢測證實分子結構與設計相符、末端雙鍵官能團置換度96.3%；高效液相色譜檢測顯示產物純度為98.4%；基質輔助激光解吸電離檢測提示產物實際平均分子量與設計結構分子量相符；凝膠過濾色譜檢測結果顯示產物多分散性數值為1.02,產物分子量均一,純度較高。 結論：通過接枝聚合方法制備4branched-PEG-DA在分子結構、目標官能團置換度、終產物產率、分子量及產物純度方面均符合實驗設計、滿足后續(xù)實驗要求。 第二節(jié)基質金屬蛋白酶酶解控釋血管內皮生長因子聚乙二醇水凝膠制備及釋藥性能研究 目的：制備基質金屬蛋白酶酶解控釋血管內皮生長因子聚乙二醇水凝膠(VEGF-MMP多肽PEG gel),觀察其形貌結構并研究酶解控釋效應,為后續(xù)實驗奠定基礎。 方法：運用9-芴甲氧羰基(Fmoc)多肽固相法合成含有巰基(-SH)的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)底物多肽。利用4branched-PEG-DA與血管內皮生長因子165(vascular endothelial growth factor 165, VEGF-165)共價結合后,根據Michael加成反應原理,與含有巰基的MMP底物多肽結合生成VEGF載藥聚乙二醇水凝膠(VEGF-MMP多肽PEG gel)。通過大體形態(tài)及掃描電鏡觀察VEGF-MMP多肽-PEG gel形貌及微觀結構。運用酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA),研究基質金屬蛋白酶2(MMP-2)與VEGF-MMP多肽PEG gel之間酶解釋藥的關系。 結果：室溫下VEGF-MMP多肽PEG gel大體形態(tài)為透明果凍狀。經掃描電鏡觀察,水凝膠表面微觀形態(tài)呈網狀。其中對MMP敏感的VEGF-MMP多肽PEG gel (VEGF-MMP (W) X-PEG gel)表面孔隙平均直徑為0.251±0.10lum,孔隙率為10.1±1.21%。ELISA檢測結果顯示,VEGF-MMP多肽-PEG gel對VEGF-165包封率為84.33±1.18%。凝膠形態(tài)崩解時相及ELISA檢測結果顯示,在不同濃度MMP-2作用下,VEGF-MMP (W) X-PEG gel具有穩(wěn)定的VEGF釋放速率。 結論：通過Michael加成反應制備的VEGF-MMP (W) X-PEG gel與MMP-2具有穩(wěn)定的控釋關系,滿足后續(xù)實驗要求。 第二部分：VEGF控釋水凝膠-去細胞瓣復合支架制備及體外生物相容性研究 第一節(jié)VEGF控釋水凝膠-去細胞瓣復合支架的制備與鑒定 目的：制備VEGF控釋水凝膠-去細胞瓣復合支架,并通過形態(tài)學觀察和免疫熒光染色鑒定是否成功構建復合支架 方法：運用生物素(Sulfo-NHS-SS-Biotin)修飾去細胞瓣支架,行免疫熒光染色鑒定。根據親和素-生物素結合原理,將含有生物素的VEGF控釋水凝膠(VEGF-bio-MMP(W)X-PEG gel)與去細胞瓣支架復合,行HE染色和掃描電鏡觀察。 結果：結合生物素的去細胞瓣支架,經攜帶Cy3熒光親和素染色,熒光顯微鏡顯示瓣膜基質呈紅色。形態(tài)學觀察顯示,水凝膠-去細胞瓣復合支架具有去細胞瓣三層基質結構和凝膠規(guī)則網狀孔隙微觀結構。 結論：按實驗設計成功制備VEGF控釋水凝膠-去細胞瓣復合支架。 第二節(jié)VEGF控釋水凝膠-去細胞瓣復合支架體外生物相容性研究 目的：參照GB/T1688國家標準,體外研究VEGF控釋水凝膠-去細胞瓣復合支架生物相容性。 方法：參照GB/T1688國家標準,對復合支架進行血液相互作用實驗,研究其對血小板激活、凝血時間、溶血的影響；對復合支架及其浸提液進行細胞毒性實驗,研究其對細胞增殖與凋亡的影響。 結果：經掃描電鏡,流式細胞儀檢測,證實復合支架可減少去細胞瓣對血小板的粘附與激活；經PT/APTT/INR檢測,證實復合支架對凝血時間無明顯影響；經間接、直接溶血實驗,證實復合支架溶血率低于GB/T16886國家標準；經細胞增殖、凋亡檢測,證實復合支架及其浸提液對MRC-5人胚肺細胞無明顯影響。 結論：參照GB/T1688國家標準,VEGF控釋水凝膠-去細胞瓣復合支架具有良好的生物相容性。 第三部分：智能水凝膠-去細胞瓣復合支架制備及體內生物學性能研究 第一節(jié)智能水凝膠-去細胞瓣復合支架的制備與鑒定 目的：制備抗CD34抗體-VEGF控釋水凝膠-去細胞瓣復合支架(智能水凝膠-去細胞瓣復合支架),并通過免疫熒光染色鑒定是否成功構建復合支架 方法：運用生物素(Sulfo-NHS-SS-Biotin)修飾去細胞瓣支架。根據親和素-生物素結合原理,將VEGF-b i o-MMP(W)X-PEG gel與去細胞瓣支架復合。同樣原理,將經生物素化抗CD34抗體與水凝膠-去細胞瓣支架復合,行免疫熒光染色鑒定。 結果：結合抗CD34抗體水凝膠-去細胞瓣復合支架,經FITC標記抗IgG抗體染色,熒光顯微鏡顯示瓣膜基質呈綠色。 結論：按實驗設計成功制備智能水凝膠-去細胞瓣復合支架。 第二節(jié)智能水凝膠-去細胞瓣復合支架體內生物學性能研究 目的：建立兔頸動脈瓣膜管道移植模型,評估智能水凝膠-去細胞瓣復合支架體內生物學性能 方法：運用改良兔頸動脈"Cuff"套管技術,建立兔頸動脈瓣膜管道移植模型。分別于術后24小時和7天,通過多普勒彩色超聲檢測管道通暢與否,判斷動物模型建立是否成功。術后24小時,取出移植物,根據組織形態(tài)學檢測,評估移植管道對CD34+細胞的粘附能力。術后7天,取出移植物,根據組織形態(tài)學檢測及eNOS mRNA定量分析,評估移植管道內皮化程度。 結果：超聲結果顯示移植管道通暢,兔頸動脈瓣膜管道移植模型建立成功。術后24小時,相應檢測結果顯示,本實驗制備復合支架對CD34+細胞有明顯的粘附能力。術后7天,相應檢測結果顯示,本實驗制備復合支架內皮化程度優(yōu)于對照組支架。 結論：智能水凝膠-去細胞瓣復合支架具有優(yōu)良的生物學性能。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

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本文編號：2392022