【摘要】：研究背景 隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、社會(huì)進(jìn)步,人們對(duì)生活質(zhì)量的要求不斷的提高,人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)和人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)近年來(lái)在全球范圍手術(shù)量也急劇上升。雖然人工全髖置換和人工全膝置換手術(shù)術(shù)式已經(jīng)幾近完美,但是植入物材料的壽命有限(20年左右),已然不能滿足現(xiàn)在老齡化的要求。鈦及鈦合金由于其耐磨性好、抗腐蝕性強(qiáng)、良好的力學(xué)性能和生物相溶性而廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)植入材料。但是鈦屬于生物惰性材料,生物活性差,缺乏骨誘導(dǎo)作用。鈦假體植入體內(nèi)后其周圍可能形成纖維組織包裹、骨溶解,導(dǎo)致假體松動(dòng)。腰椎內(nèi)固定松動(dòng)是腰椎手術(shù)失敗術(shù)后疼痛的主要常見(jiàn)原因。螺釘表面納米化修飾,促進(jìn)成骨,增強(qiáng)螺釘-骨界面融合。通過(guò)假體表面設(shè)計(jì)可賦予其生物活性,促進(jìn)骨生長(zhǎng),提高骨融合率,提高骨-材料界面的強(qiáng)度,延長(zhǎng)假體壽命,是目前研究的熱點(diǎn)。 納米技術(shù)近年來(lái)廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域,如醫(yī)藥領(lǐng)域、機(jī)械領(lǐng)域等。當(dāng)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元(如晶�；蚩紫�)小到納米級(jí),其性質(zhì)就會(huì)發(fā)生重大改變,不僅改善了原來(lái)材料的性能,甚至使原材料具有新的性能或效應(yīng)。納米材料在光學(xué)、催化、熱學(xué)、光化學(xué)以及敏感特性等方面具有一系列獨(dú)特的性質(zhì)。拋光表面構(gòu)建納米結(jié)構(gòu)有望提高細(xì)胞的生物學(xué)行為。已有大量研究表面納米表面可影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。Dalby等發(fā)現(xiàn)27nm的納米結(jié)構(gòu)可促進(jìn)人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。另一研究發(fā)現(xiàn),13nm的“納米島”結(jié)構(gòu)可促進(jìn)細(xì)胞增殖,基因表達(dá)的上調(diào),而95nm的“納米島”則抑制細(xì)胞的增殖,下調(diào)基因表達(dá)。Sjostrom等通過(guò)鋁模版構(gòu)建不同規(guī)格的納米棒,結(jié)果表明15nm長(zhǎng)的納米棒可明顯促進(jìn)hMSCs增殖、分化。不同的納米長(zhǎng)度對(duì)細(xì)胞可能起到不同的生物學(xué)作用。 本研究在室溫下應(yīng)用電化學(xué)陽(yáng)極氧化法構(gòu)建納米棒形貌,通過(guò)調(diào)節(jié)電化學(xué)參數(shù)可控制納米棒長(zhǎng)度,簡(jiǎn)單易行,且無(wú)需應(yīng)用模版。通過(guò)構(gòu)建不同長(zhǎng)度的納米棒形貌,進(jìn)行體外培養(yǎng)MSCs,研究其對(duì)細(xì)胞黏附、增殖、成骨分化等影響；通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),研究不同長(zhǎng)度的納米棒表面與骨界面結(jié)合能力及強(qiáng)度。 目的 1、明確鈦基納米棒的表面形態(tài)及性質(zhì)； 2、明確鈦基納米棒的生物學(xué)相容性； 3、明確不同長(zhǎng)度的鈦基納米棒對(duì)MSCs細(xì)胞生物學(xué)行為的影響； 4、初步探討不同長(zhǎng)度的鈦基納米棒調(diào)節(jié)MSCs細(xì)胞功能的機(jī)制； 5、探討鈦基納米棒植入體內(nèi)后與骨組織的結(jié)合程度。 研究方法 1,材料的制備：選用醫(yī)用鈦片除去鈦基片表面的油污和附著物,接著用去離子水沖洗表面。拋光、去離子水沖洗,采用陽(yáng)極氧化恒流法,以鈦箔為陽(yáng)極,銅片為陰極,采取直接加電流法,分別反應(yīng)20min,30min,40min制備不同長(zhǎng)度的鈦納米棒。 2,采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡及原子力顯微鏡觀察Ti,30nm Ti,100nm Ti和120nm Ti的表面形態(tài),用能譜分析研究其元素組成；通過(guò)蛋白吸附實(shí)驗(yàn)研究4種不同的材料表面對(duì)蛋白的吸附能力。 3, Ti,30nm Ti,100nm Ti和120nm Ti四種材料進(jìn)行生物相容性實(shí)驗(yàn),采用乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液,MTT法檢測(cè)四種材料對(duì)L929細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響,鈣黃綠素死活染色法觀察四種材料表面的細(xì)胞狀態(tài),從而綜合評(píng)價(jià)納米表面改性后材料的生物安全性。 4, Ti,30nm Ti,100nm Ti和120nm Ti四種材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)復(fù)合培養(yǎng),進(jìn)而研究細(xì)胞在四種材料表面上30min、60min及120min的早期細(xì)胞黏附,采用掃描電鏡研究MSCs細(xì)胞在四組材料表面的黏附形態(tài)；采用MTT法檢測(cè)MSCs細(xì)胞在四組材料表面1、3、5天增殖活力；MSCs細(xì)胞與四組材料復(fù)合培養(yǎng)14天后,采用pNPP法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶含量,用胞內(nèi)總蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,觀察四組材料對(duì)MSCs細(xì)胞的成骨分化的影響；MSCs細(xì)胞與四組材料復(fù)合培養(yǎng)21天后進(jìn)行茜素紅染色,研究四種材料對(duì)MSCs礦化的影響。 5, Ti,30nm Ti,100nm Ti和120nm Ti四種材料與MSCs細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)24h后,用FITC-Phalloidin對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色,并在免疫熒光下觀察細(xì)胞骨架、測(cè)量細(xì)胞的長(zhǎng)、短軸,利用長(zhǎng)/短軸的比值來(lái)分析細(xì)胞黏附在四種材料表面上的形態(tài)；4種材料與MSCs細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)14d后,采用PCR法測(cè)量材料表面成骨相關(guān)基因表達(dá)量(OCN、OPN、ALP、RUNX2和COL-1)。 6,將Ti及100nm Ti兩種植入材料,植入新西蘭大白兔子體內(nèi),術(shù)后4、12周耳靜脈空氣注入處死大白兔,切成只剩余有植入物的小段,在內(nèi)固定系統(tǒng)中干燥存放,進(jìn)行Micro-CT斷層掃描,觀察植入材料-骨界面的結(jié)合程度；選擇術(shù)后4、12周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行材料與骨界面的破壞載荷測(cè)試材料-骨界面的結(jié)合強(qiáng)度；將骨組織固定、包埋、組織切片后,進(jìn)行Masson染色,在顯微鏡下觀察并采集圖像,分析材料-骨界面的成骨效果。 7,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間數(shù)據(jù)應(yīng)用析因設(shè)計(jì)方差分析、One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩兩比較采用LSD法。方差不齊時(shí),采用Dunnetts T3比較。α=0.05,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.材料表面形態(tài)及表征 1.1SEM觀察材料表面 SEM結(jié)果顯示鈍鈦基片在1.45wt%NH4F和1.93wt%H2C2O4混合電解液中制備鈦納米棒,采取直接加電流法,調(diào)節(jié)到200mA后帶電放入電解液中,分別反應(yīng)20min,30min,40min分別制備出平均長(zhǎng)度為30nm,100nm,120nm的納米棒結(jié)構(gòu)。 1.2材料表面能譜分析 能譜分析結(jié)果顯示了鈦基片和鈦基納米棒表面元素組成及元素的比例,結(jié)果提示鈦基片和鈦基納米棒表面組成一樣,都是100%Ti元素。 1.3AFM觀察材料表面 AFM觀察各組材料表面并測(cè)量各個(gè)樣品的粗糙度,對(duì)照組Ti的粗糙度最低,隨著納米棒的長(zhǎng)度增加,粗糙度越大。4種表面的粗糙度分別是：7.76±1.49nm,9.51±1.26nm,13.45±1.49nm and19.06±4.19nm。 1.4早期蛋白黏附 材料的早期蛋白黏附結(jié)果顯示四種材料的早期蛋白黏附無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2.鈦基納米棒的生物相容性研究 2.1LDH細(xì)胞毒性檢測(cè) 不同材料試樣與L929細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)24h后,各組間細(xì)胞培養(yǎng)液的LDH活性無(wú)明顯差異,說(shuō)明對(duì)照鈦和鈦納米棒均無(wú)細(xì)胞毒性。 2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率結(jié)果顯示Ti、30nm Ti、100nm Ti及120nm Ti四種材料的細(xì)胞毒性分級(jí)均為0或1級(jí),表明四種材料穩(wěn)定,均無(wú)細(xì)胞毒性,為合格的生物材料。 2.3Calcein-AM/EthD-1死活染色法 Calcein-AM/EthD-1死活染色結(jié)果顯示4種材料表面培養(yǎng)的L929細(xì)胞活性好,大部分為綠染色,表明四種材料均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性,為合格的生物材料。 3.不同長(zhǎng)度的鈦基納米棒對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物行為的影響 3.1SEM觀察細(xì)胞黏附形態(tài) 細(xì)胞與材料共培養(yǎng)24h后,可見(jiàn)細(xì)胞與各組材料的黏附好,高倍鏡下,可見(jiàn)到細(xì)胞在對(duì)照組的鈦表面上貼壁展開,細(xì)胞扁平,細(xì)胞之間接觸良好；而在納米表面上的細(xì)胞呈梭形,其中100nm Ti表面的細(xì)胞最為狹長(zhǎng)(長(zhǎng)／寬比最大)。四種材料的長(zhǎng)／寬比：100nm Ti30nm Ti120nm TiTi。 3.2DAPI早期細(xì)胞黏附 MSCs在不同表面上30min,60min及120min的黏附結(jié)果表明：四組材料與細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)30min后,100nm Ti和120nm Ti表面的細(xì)胞黏附明顯高于對(duì)照組(P0.05),120nmTi與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中100nm Ti表面黏附的細(xì)胞最多；復(fù)合培養(yǎng)60min后,各組材料表面黏附的細(xì)胞明顯較30min多,3組納米表面黏附的細(xì)胞均較對(duì)照組多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),100nm Ti30nm Ti120nm TiTi。復(fù)合培養(yǎng)120min后,各組材料表面黏附的細(xì)胞明顯較30min和60min多,100nm Ti和120nm Ti兩組納米表面黏附的細(xì)胞均較對(duì)照組多,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),120nm Ti與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,100nm Ti30nm Ti120nm TiTi。 3.3MTT細(xì)胞增殖活力檢測(cè) Ti,30nm Ti,100nm Ti和120nm Ti四種表面復(fù)合培養(yǎng)MSCs細(xì)胞,比較1d,3d和5d各組材料表面的細(xì)胞增殖活力。結(jié)果表明：各組材料的細(xì)胞生殖活力有顯著性差異(P0.01)；每組材料的OD值隨著時(shí)間而增加,符合細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；每組材料在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖活力有顯著性差異(各組P值均0.01)。相同的時(shí)間點(diǎn),不同的材料也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(1D：P=0.013；3D：P=0.000；5D：P=0.000；P值均0.05)；納米表面均比對(duì)照鈦OD值高,表明鈦基納米棒表面的增殖活力高于對(duì)照鈦表面。 細(xì)胞培養(yǎng)1天后,納米表面的OD值均高于對(duì)照鈦,但與對(duì)照鈦相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；培養(yǎng)3天后,納米表面的OD同樣高于對(duì)照鈦,且100nm Ti和120nm Ti的OD值與對(duì)照鈦相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差意義(P0,05)；培養(yǎng)5天后,各組納米表面的OD值仍然高于對(duì)照鈦,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表明納米表面的增殖活力均較對(duì)照鈦強(qiáng)。其中100nm Ti表面的細(xì)胞增殖活力最強(qiáng),與任一組材料比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),表明100nm Ti的細(xì)胞增殖活力最強(qiáng)�？傮w來(lái)說(shuō),100nmTi的細(xì)胞增殖活力最大,其次是120nm Ti,接著是30nm Ti,對(duì)照鈦的細(xì)胞增殖活力最小。 3.4ALP活性檢測(cè) ALP檢測(cè)結(jié)果顯示,培養(yǎng)14天后MSCs細(xì)胞在100nm Ti表面的ALP活性高于對(duì)照組Ti表面,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。30nm Ti和120nm Ti表面與對(duì)照組Ti表面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(P0.05)。四種ALP活性的比較：100nm Ti30nm Ti120nm TiTi. 3.5礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色 茜素紅染色法檢測(cè)MSCs細(xì)胞在不同材料表面上培養(yǎng)21后的礦化程度。從圖中可以發(fā)現(xiàn)100nm Ti礦化程度最高,與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而30nm Ti和120nm Ti與對(duì)照組相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明100nm Ti表面可促進(jìn)MSCs細(xì)胞礦化。 4.鈦基納米棒促M(fèi)SCs成骨分化機(jī)制的初步探討 4.1免疫熒光觀察胞骨架和細(xì)胞形態(tài) 免疫熒光常用于觀察細(xì)胞-材料表面接觸,分析細(xì)胞黏附,形態(tài)以及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu),比如細(xì)胞骨架。通過(guò)測(cè)量經(jīng)過(guò)細(xì)胞核中心的細(xì)胞長(zhǎng)軸和短軸,計(jì)算長(zhǎng)／寬比值,研究細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在對(duì)照Ti組上的細(xì)胞鋪展良好,細(xì)胞骨架清晰可見(jiàn),細(xì)胞相互之間有接觸。細(xì)胞在30nm Ti和100nm Ti表面的長(zhǎng)／寬比值明顯比對(duì)照Ti組大,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),表明細(xì)胞形狀更為瘦長(zhǎng)。但是細(xì)胞在120nm Ti表面鋪展?fàn)顟B(tài)最差,提示120nm Ti可能抑制細(xì)胞鋪展。細(xì)胞在4組材料表面上的長(zhǎng)／寬比從大到小分別是：100nm Ti30nm Ti120nm TiTi。 4.2PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因 PCR檢測(cè)MSCs細(xì)胞復(fù)合4種材料培養(yǎng)14天后材料表面的基因表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)100nm Ti表面可顯著提高ALP, OCN和OPN的基因表達(dá)；4種材料表面的RUNX2和COL-1基因表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 5.鈦納米棒的動(dòng)物植入實(shí)驗(yàn) 5.1材料植入實(shí)驗(yàn)用兔子體內(nèi)后,所有兔子術(shù)后活動(dòng)及進(jìn)食正常,術(shù)后創(chuàng)口愈合良好,未出現(xiàn)傷口感染及炎癥反應(yīng)。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材,材料植入?yún)^(qū)域未見(jiàn)組織壞死、化膿等。 5.2Micro-CT檢測(cè) Micro-CT圖像觀察Ti和100nm Ti植入兔子體內(nèi)4、12周后材料-骨界面的結(jié)合程度。Ti植入4周后,材料與骨界面之間可見(jiàn)縫隙；12周后骨-材料界面的結(jié)合程度較術(shù)后4周明顯改善。100nm Ti植入后4周,材料與骨界面結(jié)合明顯較Ti好；12周后骨-材料界面的結(jié)合緊密,未見(jiàn)縫隙。 5.3生物力學(xué)測(cè)試 Ti和100nmTi植入兔子體內(nèi)4、12周后生物力學(xué)測(cè)試,材料與骨接觸面的破壞載荷。結(jié)果表明：Ti和100nmTi植入動(dòng)物體內(nèi)4周后,兩組間的破壞載荷有明顯差異(P0.05),100nm組明顯大于Ti組,表明100nmTi與骨接觸較好,材料-骨界面新骨形成。植入12周后,兩組材料的破壞載荷均較4周明顯提升(P0.05),但100nmTi表面的破壞載荷仍明顯高于對(duì)照組(P0.05),說(shuō)明100nmTi表面可促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖及成骨分化,可促進(jìn)骨生長(zhǎng),提高骨融合率,更有利于材料-骨界面的骨整合,提高骨-材料界面的強(qiáng)度。 5.4Masson染色 Ti植入骨4,8周后,可見(jiàn)材料周圍大量紅染,為成熟骨質(zhì),材料-骨界面無(wú)新骨形成,材料-骨界面間存在明顯間隙。而100nm Ti植入4周后,可以現(xiàn)紅藍(lán)相間的組織,有少量Ⅰ型膠原產(chǎn)生。植入8周后,材料-骨界面緊貼,界面間可間藍(lán)色新生骨,表明100nm Ti有促成骨作用。 結(jié)論 1.本研究應(yīng)用簡(jiǎn)單的工藝流程,無(wú)需模版,以1.45wt%NH4F和1.93wt%H2C2O4的混合液為電解液,在室溫、恒流模式下陽(yáng)極氧化反應(yīng)成功制備出Ti納米棒陣列；反應(yīng)20min,30min和40min制備出30nm,100nm和120nm的Ti鈦基納米棒；AFM顯示各組材料的粗糙度隨著納米棒長(zhǎng)度增長(zhǎng)而增加,但各組材料的早期蛋白黏附未見(jiàn)明顯異常。 2.采用乳酸脫氫酶法、MTT比色法以及鈣黃綠素細(xì)胞死活染色法,分別從細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞增殖以及直觀觀察三種不同角度、不同方法來(lái)觀察四種不同材料的細(xì)胞毒性。三種方法相互印證,表明了本研究采用的鈦以及其表面改性的納米棒結(jié)構(gòu)均無(wú)細(xì)胞毒性,是合格的生物材料。 3.電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞與各組材料的黏附好,100nm Ti的細(xì)胞形態(tài)最為狹長(zhǎng)；DAPI早期細(xì)胞黏附結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米表面均比對(duì)照組細(xì)胞黏附多,其中100nm Ti的早期細(xì)胞黏附最多；MTT細(xì)胞增殖活力表明納米表面可明顯促進(jìn)MSCs細(xì)胞增殖,其中100nm Ti在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量都是最多的；ALP活性檢測(cè)表明100nm Ti表面可促進(jìn)MSCs細(xì)胞成骨分化；茜素紅染色法檢測(cè)結(jié)果表明100nm Ti表面可促進(jìn)MSCs細(xì)胞礦化。 4.細(xì)胞在30nm Ti和100nm Ti表面的長(zhǎng)/寬比值明顯比對(duì)照Ti組大,細(xì)胞形狀更為瘦長(zhǎng),細(xì)胞在4組材料表面上的長(zhǎng)/寬比從大到小分別是：100nmTi30nm Ti120nm TiTi; PCR檢測(cè)4組材料表面的成骨基因表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)100nm Ti表面可顯著提高ALP, OCN和OPN的基因表達(dá)。 5. Micro-CT橫斷掃描結(jié)果顯示100nm Ti骨-材料界面的結(jié)合緊密程度均較Ti好；100nm Ti表面的破壞載荷均明顯高于對(duì)照組,表明100nm Ti可促進(jìn)骨生長(zhǎng),提高骨融合率,提高骨-材料界面的強(qiáng)度；Masson三色染色結(jié)果表明,100nmTi界面間可間藍(lán)色新生骨,表明100nm Ti有促成骨作用。 本文通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)研究,在鈦表面成功構(gòu)建了長(zhǎng)度的納米棒陣列,利用納米形貌修飾的鈦表面可影響間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化功能,促進(jìn)鈦-骨界面的骨愈合,為鈦植入物表面納米化形貌修飾的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R318.17

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號(hào)：2354238