【摘要】：第一部分新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM的生物毒性 目的：交大鎂合金系列（Jiao Da bio-magnesium series, JDBM）是上海交通大學輕合金精密成型國家工程研究中心設計開發(fā)的生物相容性好、強度和塑韌性相匹配、腐蝕行為近乎均勻的新型高性能生物醫(yī)用Mg-Nd-Zn-Zr (平衡-3-0.2-0.4wt.%)基合金系列，分為2類，JDBM1具有高強度和中等塑性，應用于骨科；JDBM2具有高塑性和中等強度，應用于血管支架。該合金體系添加了少量細胞毒性輕微的輕稀土元素Nd作為低合金化元素，Nd的加入可以保證鎂合金具有良好的時效析出強化和固溶強化效果，并可大幅度提高合金基體的電極電位，減小基體與第二相的電偶腐蝕電位差，從而提高鎂合金的耐均勻腐蝕性能。Zn是人體生理需要的微量元素，微量加入可提高合金強度及塑性加工能力；微量Zr作為晶粒細化劑可提高合金的強韌性和耐蝕性，其在鎂合金中的生物相容性已經(jīng)證實。JDBM的強度、柔韌性、耐蝕性能和生物相容性全面超越已經(jīng)在歐洲進入臨床實驗的WE43鎂合金。相比于商業(yè)性的WE43和AZ31鎂合金，JDBM具有更好的生物相容性。JDBM在體內90天時基本完好，在180天時降解少于40%。本實驗的目的，即通過研究含輕稀土Nd元素的JDBM鎂合金及單純的Nd對體外培養(yǎng)的小鼠胚胎成骨細胞株MC3T3-E1的毒性，分析JDBM鎂合金中稀土元素Nd的體外成骨細胞毒性，體內實驗部分通過研究Nd對昆明小鼠骨及周圍組織的生理病理影響，以及其在小鼠各器官組織中的分布，來研究Nd的生物安全性及其動物體內分布情況。 方法：按標準方法用aMEM培養(yǎng)基制作Nd的浸提液，并稀釋為1/2、1/4、1/8幾個不同的濃度梯度，同時制作Ti合金、WE43鎂合金、JDBM鎂合金及CaP涂層JDBM鎂合金的浸提液，以正常培養(yǎng)組做空白對照，以Ti合金浸提液組做陰性對照，以0.64%苯酚組做陽性對照，用含10%澳洲胎牛血清的aMEM培養(yǎng)基對MC3T3-E1成骨細胞進行培養(yǎng)，觀察其不同時間的形態(tài)變化及增殖情況，并以CCK8法檢測其不同時間的細胞增殖活性，以Annexin V PI雙染色流式細胞術檢測不同時間的細胞凋亡情況。將梯度量的Nd微粒加入正常培養(yǎng)的成骨細胞培養(yǎng)液中，最低量接近JDBM植入物釋放的Nd量，觀察微粒入胞情況，并制作細胞爬片，用電子目鏡接普通顯微鏡直接動態(tài)觀察細胞吞噬Nd微粒的情況，然后行HE染色觀察細胞形態(tài)變化。體內實驗部分，將不同量的Nd微粒置于小鼠股骨旁組織，檢測1、3、5天小鼠的血液電解質、肝腎功能變化、Nd在小鼠體內的分布及局部病理切片觀察Nd微粒引起的病理變化。 結果：用CCK8法檢測細胞增殖活性，Nd浸提液原液組細胞毒性較大，與苯酚陽性對照組實驗結果一致，其與正常對照組、Ti合金浸提液組、JDBM浸提液組、WE43浸提液組、Nd浸提液1/4、1/8濃度組相比P 0.00001，而后幾者之間無明顯統(tǒng)計學差異。Nd浸提液原液及苯酚組與Nd浸提液稀釋至1/2組之間P 0.01，有明顯統(tǒng)計學差異。從流式細胞術檢測結果得知，隨Nd浸提液濃度及作用時間的增加，成骨細胞凋亡明顯增多。微粒入胞實驗動態(tài)及靜態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，成骨細胞通過主動胞吞作用吞噬周圍環(huán)境中的Nd微粒，微粒較少時細胞生長無明顯影響，微粒量多時則可導致成骨細胞膜破裂，直至細胞崩解死亡。通過計算比較，JDBM及WE43中Nd2.5%左右的含量可能會導致周圍細胞的損傷。將不同量的Nd微粒置于小鼠股骨旁組織，小鼠的血液電解質及肝腎功能較正常組無明顯變化。小鼠體內各組織器官的Nd元素分布因無合適的檢測合作單位而待測，病理組織切片顯示大量的Nd微粒對周圍組織細胞有一定的損傷。 結論： Nd浸提液的成骨細胞毒性及對成骨細胞凋亡的影響隨濃度的減小而減小，JDBM中微量Nd對成骨細胞無明顯毒性；成骨細胞通過主動胞吞作用攝取周圍環(huán)境中的Nd微粒，當微粒數(shù)量達到一定程度時，成骨細胞崩解，JDBM中微量Nd顆粒對成骨細胞的增殖及形態(tài)無明顯不良影響。相對于Nd微粒的細胞損傷，JDBM和WE43中的Nd含量可能過高。Nd微粒對小鼠的肝腎功能、電解質無明顯影響，多量的Nd微粒對周圍組織細胞有一定的損傷。 第二部分新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM的髓內降解及病理生理效應 目的：生物體內可降解吸收材料是生物材料發(fā)展的重要方向，由于金屬材料具有較好的強度和塑韌性，因此金屬基可降解吸收材料具有重要的臨床應用價值。鎂是所有金屬材料中生物力學性能與人體骨最接近的金屬材料，具有理想的生物力學相容性，因此，鎂合金作為可降解生物材料具有巨大的應用潛力。目前臨床應用的生物體內可降解吸收材料主要是聚合物和某些陶瓷材料，如聚乳酸、磷酸鈣等。但由于聚合物材料強度偏低、陶瓷材料的塑韌性較差限制了其廣泛使用。近年來，以生物可降解鎂合金(biodegradablemagnesium alloys)為主要代表的具有生物可降解(吸收)特性的新一代醫(yī)用金屬材料的研究受到了人們的特別關注。鎂合金因具有與人體骨頭接近的密度和彈性模量、高比強度和比剛度、生物可降解性以及生物相容性等優(yōu)點，近10年來國內外研究人員對其應用于骨內植物、骨組織工程支架和心血管支架等領域進行了廣泛的研究。然而，目前大多數(shù)研究均以現(xiàn)有商用鎂合金為對象，如含Al元素的AZ31、AZ91以及含重稀土元素的WE43等，并未考慮到作為生物材料的安全性等問題。上海交通大學輕合金精密成型國家工程研究中心，作為我國重要的鎂合金材料及精密成型工藝研究的國家級研究基地，近年來在可降解醫(yī)用鎂合金材料研究領域也取得了令國際同行矚目的研究成果。該研究中心研究人員與醫(yī)學研究人員合作，積極開展生物醫(yī)用鎂合金材料的臨床應用基礎研究。上海交通大學研究人員運用第一性原理計算與分子動力學模擬方法，并與實驗相結合，從原子、分子水平深入系統(tǒng)地探索了鎂的變形機制，定量評估了所優(yōu)選的生物相容性好的合金元素對鎂中層錯能及位錯滑移、孿生等變形傾向的影響，設計開發(fā)了生物相容性好、強度和塑韌性相匹配、腐蝕行為接近均勻腐蝕的新型高性能生物醫(yī)用鎂合金Mg-Nd-Zn-Zr基合金系列(Jiao Dabio-magnesium series，簡稱JDBM)，已經(jīng)分別申請中國和國際專利保護。該合金體系中通過加入少量細胞毒性輕微(臨床可接受)的輕稀土元素Nd作為低合金化元素，Nd的加入可以保證鎂合金具有良好的時效析出強化和固溶強化效果，并可大幅度提高鎂合金基體的電極電位，減小基體與第二相的電偶腐蝕電位差，從而提高鎂合金的耐均勻腐蝕性能。JDBM可降解鎂合金自研制成功以來，一直在進行各項臨床前實驗研究，以了解其各項生物學性能，以便進一步改進其各項性能并爭取早日應用于臨床醫(yī)療實踐中。我們已經(jīng)做了一些JDBM鎂合金釘板系統(tǒng)方面的研究，取得了許多重要的第一手資料，但尚未進行JDBM鎂合金髓內針方面的實驗研究。本實驗的目的在于檢測可降解JDBM鎂合金髓內針對大鼠股骨代謝的影響及其病理生理變化，并檢測JDBM鎂合金髓內針在大鼠股骨髓腔內的降解行為，通過動物實驗研究對本材料的醫(yī)用價值做出一定程度的評估。 方法：將JDBM鎂合金及對照的Ti合金、WE43鎂合金、CaP涂層JDBM做成1mm x30mm的髓內針，消毒后進行無菌手術將其植入雄性SD大鼠左側股骨髓腔內，每組6只。在1、3個月進行99mTc-MDP骨三相掃描及SPECT-CT檢查，通過骨顯像核素掃描了解大鼠股骨植入JDBM鎂合金髓內針后的代謝狀況，比較與對照側及對照組的差異。1、3個月拍攝X線片了解髓內針的位置與降解的大體情況。在15天，1、3、6個月檢測大鼠的血生化電解質變化。3、6個月做骨組織病理硬切片，通過骨硬組織切片觀察大鼠股骨的病理變化，并檢測不同時間髓內針的降解情況，確定其降解速率。 結果：JDBM髓內針組大鼠股骨的放射性標記物攝取率明顯高于對側股骨及Ti合金對照組，P0.01，與WE43組及CaP涂層JDBM組相比無明顯差異。骨三相掃描顯示鎂合金髓內針植入側血供旺盛。血電解質檢測各組未見明顯差異。大鼠股骨X線片攝片顯示，1、3月時JDBM髓內針形態(tài)完好，密度均勻，但6、8月時影像略顯模糊，X線透光程度不等，CaP涂層JDBM髓內針及WE43髓內針也出現(xiàn)程度不等的類似變化，可能系鎂合金刺激周圍骨組織增生所致。大鼠骨硬組織病理切片顯示，JDBM髓內針在大鼠髓腔內緩慢降解，并促進骨組織增生，未見明顯畸形細胞。與Ti合金組相比，JDBM及CaP涂層JDBM組、WE43組髓內針周圍成骨明顯。1個月、3個月、6個月的時間內，JDBM髓內針在大鼠骨髓腔內緩慢降解，至6個月時降解不超過20%，直徑由最初的1mm至大于0.8mm，質量減少不超過20%，而CaP涂層JDBM組降解更為緩慢，WE43組降解略快于JDBM組，Ti合金組無降解。 結論： JDBM對實驗動物大鼠的血清肝腎功能、電解質無明顯影響。JDBM在大鼠髓腔內4個月時降解比較輕微，刺激周圍骨組織增生的作用已經(jīng)顯現(xiàn)，6個月時周圍骨組織明顯增生，相應的JDBM髓內針影像略顯模糊，應力遮擋效應減弱。JDBM等鎂合金髓內針可導致大鼠局部核素攝取增多，表明局部代謝旺盛，鎂合金有促進大鼠髓腔內代謝的作用。JDBM髓內針可促進骨代謝及骨形成，有利于損傷骨組織的修復。JDBM鎂合金髓內針在骨髓腔內逐漸降解，后期降解趨于緩慢。JDBM及CaP涂層JDBM、WE43髓內針植入大鼠股骨后，其髓腔內組織皆未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應。 第三部分新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM與葡萄球菌粘附及生物膜模型 目的：骨科假體植入后葡萄球菌感染是世界范圍內比較棘手的問題，醫(yī)療實踐中通過應用各種材料改性技術和研發(fā)新材料等方法以期減少感染的發(fā)生。關節(jié)假體感染（prosthetic joint infection，PJI）和無菌性松動是人工關節(jié)置換術后的重要并發(fā)癥。在美國，PJI是導致人工全膝關節(jié)置換術失敗的首要原因，也是人工全髖關節(jié)置換術失敗的第三大原因。微生物生物膜（biofilm，BF）作為PJI的病原基礎，對感染的發(fā)生、發(fā)展和轉歸具有決定性作用。根據(jù)臨床統(tǒng)計，導致關節(jié)假體感染的主要致病菌為表皮葡萄球菌。金黃色葡萄球菌是創(chuàng)傷感染中最常見的病原前，而且可引致敗血癥、癤、膿腫等。作為人獸共患病的重要病原菌，其致病性長期來為醫(yī)學家所關注。但往主要對凝固酶、葡澈酶等胞外酶及腸毒素、殺白細胞毒、表皮剝脫毒素及毒性休克綜合征毒素I等外毒素進行了研究，而忽視了對其牯附機制的探討。眾所周知，粘附是細菌感染的先決條件，否則細菌就無法定居和繁殖，也不能產(chǎn)生和釋放胞外酶和外毒素=粘附雖非直接導致組織受損，但對組織的選擇和疾病的嚴重程度卻有重要的影響。因此，近年來在對金黃色葡萄球菌胞外產(chǎn)物研究日漸深入的研究，同時，對其粘附機制的研究亦獲長足的進展，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌有數(shù)種粘附素。根據(jù)臨床統(tǒng)計，導致關節(jié)假體感染的主要致病菌為表皮葡萄球菌。表皮葡萄球菌存在于人體的體表，與其他正常菌群一道構成人體皮膚粘膜等的微生態(tài)共同抵御外來微生物的侵襲。同時由于寄生部位改變，在凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase Negative Staphvlococcl；CoNS)引起醫(yī)院感染中最為常見。國外報道表葡占CoNS的57％和68％，特別是在病人體內留置醫(yī)療器械引起的感染中表葡是最重要的病原之一，占39％。表皮葡萄球菌通過ica fIntercellular Adhesion)操縱子表達多聚糖胞間粘附因子(Polysaccharide Intercelluar Adhesion PIA)，使之粘附于器械靜脈導管、人造心瓣膜、人造關節(jié)、人造血管、心臟起搏器及隱形眼鏡等)表面，形成一層菌膜，以抵抗機體免疫系統(tǒng)和抗生素的攻擊，是表葡引起留置器械相關感染的重要環(huán)節(jié)。本院骨科假體感染分離出來的致病菌以表皮葡萄球菌為主。本實驗的目的在于探索新型可降解材料JDBM鎂合金對于葡萄球菌的表面粘附及生長增殖的影響，并制作JDBM鎂合金植入動物體內的感染模型，以研究新材料JDBM鎂合金的臨床適用性。 方法：將JDBM鎂合金、WE43鎂合金、Ti合金制成1mm x10mm的圓形薄片，進行環(huán)氧乙烷消毒。細菌采用RP62A、ATCC12228等菌株，用細菌比濁儀，以TSB培養(yǎng)基調節(jié)細菌濃度至約0.5麥氏單位（菌量約1x108/ml），然后在4.5ml EP管（eppendorf管）中加入2ml調好的細菌，加入無菌合金圓片共培養(yǎng)1至3天，每種材料各做一個重復培養(yǎng)的EP管。吸去TSB培養(yǎng)基，用PBS沖洗金屬片3次，然后加入2ml PBS，放入超聲震蕩儀中，中等強度超聲能量分別震蕩5、10分鐘，將所得液體分別按102、104梯度用PBS稀釋，各取100ul稀釋后的PBS菌液并劃到血平板，培養(yǎng)24小時后作細菌計數(shù)，看各組間粘附的細菌量有無差異。實驗檢測金屬片表面不同粗糙度對細菌粘附的影響。動物實驗部分，將JDBM、WE43鎂合金及Ti合金做成3mm x10mm的螺釘，用環(huán)氧乙烷熏蒸法消毒，嚴格無菌操作下將實驗螺釘植入普通級新西蘭大白兔左側股骨外上髁，手術傷口愈合后將菌株ST239、SF8300以PBS調至0.5麥氏單位，并將細菌濃度稀釋至1x105/ml，分別注射各菌株0.5ml至實驗兔的股骨旁組織靠近植入的螺釘，生理鹽水注射作為陰性對照，于注射細菌后第1、3周時拍攝實驗兔的股骨X線片，并于第3周拍攝實驗兔的股骨x線片后將其處死，做局部組織病理切片檢查，同時取局部分泌物涂片行姬姆薩染色，將細菌行血瓊脂平板培養(yǎng)一日后涂片檢查，最后進行細菌類別鑒定。 結果：開始所用的JDBM、WE43、Ti合金組材料光滑度相同，結果發(fā)現(xiàn)RP62A及ATCC12228的細菌粘附并無明顯差別，其血瓊脂培養(yǎng)板的細菌計數(shù)在一個數(shù)量級，而改變金屬圓片的表面光滑度后，再次進行實驗，發(fā)現(xiàn)粗糙度大的金屬片表面粘附了更多的細菌，其粘附細菌量的多少與粗糙度成正相關。動物實驗部分，細菌ST239注入兔股骨植入物旁，第1周和第三周時均可見發(fā)生嚴重的局部反應，有大量的乳白色乳酪樣物質產(chǎn)生，SF8300注射后局部有少量乳白色乳酪樣物質產(chǎn)生，直接涂片瑞氏染色及血瓊脂平板培養(yǎng)后涂片瑞氏染色檢查，皆發(fā)現(xiàn)大量細菌存在，經(jīng)鑒定，確定感染的細菌為實驗所注射的細菌，而生理鹽水注射后局部無明顯化膿及分泌物產(chǎn)生。 結論： JDBM、WE43、Ti合金材料本身對于葡萄球菌的粘附量無明顯差異，但不同的材料表面粗糙度對于細菌的粘附有明顯影響，材料表面粗糙度越大，細菌粘附越多，材料表面越光滑，細菌粘附越少。我們通過在實驗動物新西蘭大白兔的股骨植入物旁注射1x105濃度的細菌ST239很容易造成假體感染生物膜的動物模型，注射SF8300可以造成輕度感染，而注射生理鹽水未造成明顯的局部感染及生物膜形成。有植入的假體存在的情況下，不同種類細菌對兔股骨旁組織的感染能力及假體成膜能力不同。 第四部分JDBM鎂合金、纖維蛋白原與葡萄球菌成骨細胞內化作用 目的：在骨科感染中，多種致病葡萄球菌可以進入成骨細胞，在其中生長繁殖，產(chǎn)生毒素，破壞細胞，并造成細胞的損傷與崩解壞死，或長期存活于細胞內，導致抗生素不能對其進行殺傷。內化是生物大分子(包括細菌、病毒等)進入細胞內的膜泡轉運過程。廣義地說,內化是指活細胞在生活狀態(tài)下,自外環(huán)境中攝取物質分子的一種模式。小分子物質如水、氨基酸、單糖以及離子等,可借助細胞膜的通透性機制而直接進入細胞內。但生物大分子物質(如細菌、病毒等)不能直接通透細胞膜,常常需先在細胞膜的某些區(qū)域產(chǎn)生凹陷,將其包裹于小的膜區(qū)域內,隨后凹陷進一步向細胞質內延伸,并與細胞膜脫離,在細胞質內形成獨立的膜性小泡,引發(fā)一系列相關界膜小泡的生成、融合、轉運及分離,上述生物大分子進入細胞內的膜泡轉運全過程稱之為內化,亦稱為內吞作用(endocytosis)。其主要形式有吞噬作用(phagocytosis)、吞飲作用(pinocytosis)、受體介導的內化(receptor-mediated internalization)、越胞作用(d-iacytosis)和穿細胞吞吐作用(transcytosis)等。它是當今生命科學研究的重要課題之一。金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus, SA）能侵入成骨細胞內,其侵入能力與菌株本身特點有關。金黃色葡萄球菌侵入成骨細胞后能逃避慶大霉素的殺菌作用,這可能與臨床上骨髓炎不易為抗生素治愈有關。金黃色葡萄球菌是血源性骨髓炎及骨科植入物感染的主要來源，約有65%~70%的骨髓炎由金黃色葡萄球菌引起。有研究表明金黃色葡萄球菌能侵入某些體外培養(yǎng)的宿主細胞，如成纖維細胞、鼠的腎細胞、內皮細胞等。金黃色葡萄球菌的這種侵入真核細胞的能力可能與其引起骨髓炎的病理機制有關。表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,SE)是一種革蘭染色陽性、凝固酶陰性的葡萄球菌,一般粘附于人體的皮膚和黏膜,是重要的條件致病菌，近年來隨著留置靜脈導管，植入人工心瓣膜、人工晶體、人工假體等侵襲性操作的增加,表皮葡萄球菌的感染率不斷上升，并且由于抗生素的廣泛使用甚至濫用，導致表皮葡萄球菌耐藥菌株日益增多，出現(xiàn)了多重耐藥。表皮葡萄球菌在生物材料表面形成的生物膜是其致病的主要因素，生物膜的形成需要許多因子的參與，這些因子又受相關基因的調控。由于表皮葡萄球菌分泌的毒性因子較金黃色葡萄球菌少，導致其致病的主要因素是表皮葡萄球菌粘附于植入體內的生物材料表面形成生物膜，它不僅使宿主體內的免疫反應呈抑制狀態(tài)，促使表皮葡萄球菌增殖，而且其黏液阻礙了親水性的抗生素進入菌體發(fā)揮殺菌作用,使感染呈慢性、持續(xù)性和反復性的特點。本實驗的目的即在于研究不同的臨床株表皮葡萄球菌對成骨細胞的內化作用的差異，并研究JDBM鎂合金及纖維蛋白原對實驗細菌內化作用的影響。 方法：將MC3T3-E1成骨細胞以每孔1ml含10%澳洲胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于24孔板，每孔細胞量5x104，連續(xù)兩天更換培養(yǎng)基，至細胞生長至超過50%面積。以含胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基通過菌量比濁儀調整23株臨床株及標準對照株細菌ATCC12593的細菌濃度調至0.5麥氏單位，約1x108/ml。吸去培養(yǎng)孔內的培養(yǎng)基，每孔分別加入1ml含實驗細菌的培養(yǎng)基，置于37℃的二氧化碳孵箱孵育2小時，然后以PBS洗三次，每孔加入含90ug/ml的萬古霉素的DMEM完全培養(yǎng)基1ml，置于二氧化碳孵箱37℃培養(yǎng)2小時，以PBS洗三次去掉細胞外被萬古霉素殺死的細菌，加入0.1%曲拉通作用10min，使細胞崩以解釋放進入細胞內的細菌，將所得液體用PBS按102、104濃度梯度稀釋后，以血瓊脂平板劃板，在35℃的條件下培養(yǎng)，次日觀察平板有無細菌生長，對有細菌者比較數(shù)量級差異并計數(shù)。重復實驗3次并比較結果異同。至于纖維蛋白原對細菌內化的影響部分，將MG63骨肉瘤細胞用含10%澳洲胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于24孔板，待細胞生長至接近鋪滿底面積，把9株骨科臨床假體感染分離的致病菌及ATCC12228、ATCC12598、RP62A按1x108/ml細菌濃度，，每孔1ml細菌液接種的于各培養(yǎng)孔，每株細菌按是否加纖維蛋白原做2個復孔，培養(yǎng)3小時后，吸去培養(yǎng)液，每個培養(yǎng)孔中各加入1ml含100ug/ml萬古霉素的完全培養(yǎng)液，37℃條件下在二氧化碳孵箱內培養(yǎng)培養(yǎng)細胞并過夜。次日吸去各培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，將各培養(yǎng)孔用PBS洗3遍，然后每孔加入PBS配制的0.1%曲拉通作用10min，以使細胞崩解，釋放出進入細胞內的細菌，所得液體將原液及102稀釋液劃于血瓊脂培養(yǎng)板，在35℃的孵箱內培養(yǎng)過夜，次日觀察有無細菌生長，計數(shù)生長的細菌。纖維蛋白原和JDBM對細菌內化的影響方案基本同前。纖維蛋白原對細菌內化的影響部分，將MG63骨肉瘤細胞用含10%澳洲胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于24孔板，待細胞生長至接近鋪滿底面積，把9株骨科臨床假體感染分離的致病菌及ATCC12228、ATCC12598、RP62A按1x108/ml細菌濃度，每孔1ml細菌液接種的于各培養(yǎng)孔，每株細菌按是否加纖維蛋白原做2個復孔，培養(yǎng)3小時后，吸去培養(yǎng)液，每個培養(yǎng)孔中各加入1ml含100ug/ml萬古霉素的完全培養(yǎng)液，37℃條件下在二氧化碳孵箱內培養(yǎng)培養(yǎng)細胞并過夜。次日吸去各培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，將各培養(yǎng)孔用PBS洗3遍，然后每孔加入PBS配制的0.1%曲拉通作用10min，以使細胞崩解，釋放出進入細胞內的細菌，所得液體將原液連續(xù)10倍稀釋后劃于血瓊脂培養(yǎng)板，在37℃的孵箱內培養(yǎng)過夜，次日觀察有無細菌生長，計數(shù)生長的細菌。JDBM對細菌內化的影響部分，類似于纖維蛋白原的研究方案，用含10%FBS的Ti合金、WE43、JDBM浸提液按上述方案替換培養(yǎng)液進行實驗，觀察骨科植入材料浸提液對臨床表皮葡萄球菌內化的影響。 結果：各個臨床菌株對成骨細胞的內化作用強弱不等，有的細菌對成骨細胞的內化作用很強，有的菌株完全看不到對成骨細胞的內化。金黃色葡萄球菌的內化作用較強，毒力較大，鏡下觀察，成骨細胞中加入諸如ATCC12598等金黃色葡萄球菌0.5h，細胞內即可見細菌進入，作用時間稍長則可見細胞破壞或崩解。一般情況下，內化菌株加入成骨細胞培養(yǎng)孔中一定時間，加入萬古霉素2h，然后停止萬古霉素的作用，將干預后的細胞用PBS清洗3遍后，將清洗得到的液體劃到羊血瓊脂培養(yǎng)板上培養(yǎng)一日，有時會顯示少量細菌存在。我們的實驗結果顯示，不管有無纖維蛋白原干預，細菌內化的量沒有明顯的不同。JDBM、WE43以及Ti合金的浸提液，對于葡萄球菌內化于成骨細胞沒有明顯的影響。 結論：一般金黃色葡萄球菌毒力比表皮葡萄球菌大，其侵襲力強，內化實驗中進入成骨細胞內部的菌量多，它們在細胞內多成團生長；而表皮葡萄球菌毒力弱，侵襲力弱，內化作用也較弱，在細胞內呈散在分布。不同的臨床株表皮葡萄球菌內化作用強弱也不同。在有成骨細胞存在的情況下，某些菌株在萬古霉素作用2小時后，用PBS洗去萬古霉素，仍可在劃板培養(yǎng)時出現(xiàn)在血瓊脂培養(yǎng)板上。這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是因為細菌與成骨細胞通過某種機制發(fā)生關聯(lián)，使萬古霉素對細菌的殺傷作用減弱，或因為細菌有在空間內平均分布的趨勢，萬古霉素停止作用后細胞內存活的細菌重新移行到細胞外。我們的實驗結果發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白原及JDBM鎂合金浸提液對實驗細菌的內化無明顯影響。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08

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6 黃宇彬;景遐斌;石全;孫靜;陳學思;;生物醫(yī)用高分子材料在人造紅血球的應用研究與進展[J];中國醫(yī)療器械信息;2009年05期

7 吳一民;可降解人工骨材料研究進展[J];內蒙古醫(yī)學院學報;2005年03期

8 劉陽;譚最;;組織工程血管支架研究進展[J];武漢大學學報(醫(yī)學版);2006年01期

9 郝勇;周躍;滕海軍;曹國勇;潘勇;;聚內消旋乳酸(PDLLA)椎間融合器在椎間降解情況的實驗觀察[J];中國矯形外科雜志;2006年03期

10 周長忍,丁珊,李立華;可降解材料的制備及應用研究進展[J];中華創(chuàng)傷骨科雜志;2000年04期

相關會議論文 前10條

1 周建;華琨;段長恩;楊秀濱;;可降解材料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)/聚乳酸(PLA)體外性能研究[A];中國心臟大會（CHC）2011暨北京國際心血管病論壇論文集[C];2011年

2 高克亮;魏東芝;;可降解生物材料聚乳酸應用開發(fā)及單體生物合成的研究[A];第三屆全國化學工程與生物化工年會論文摘要集（下）[C];2006年

3 郝勇;周躍;初同偉;潘勇;王衛(wèi)東;滕海軍;;可降解材料聚內消旋乳酸(PDLLA)椎間融合器的生物力學測試[A];第八屆全國脊柱脊髓損傷學術會議論文匯編[C];2007年

4 劉承美;莫健華;邱進俊;郭曉東;鄭啟新;;光固化可降解組織工程材料的研究[A];人才、創(chuàng)新與老工業(yè)基地的振興——2004年中國機械工程學會年會論文集[C];2004年

5 上官遨宇;朱佳蕓;黃浩艷;郎美東;;e-己內酯／丙交酯接枝共聚物的合成[A];2005年全國高分子學術論文報告會論文摘要集[C];2005年

6 丁建東;景殿英;王幀;賴毓霄;余麟;唐鍵;孫建國;楊子剛;劉鵬;張歡;黃靜歡;常廣濤;吳林波;張洪;朱文;張俊川;Stefan GRAETER;;合成高分子組織工程多孔支架材料的研究[A];2005年上海市醫(yī)用生物材料研討會論文匯編[C];2005年

7 丁建東;景殿英;王幀;張正;俞麟;唐鍵;孫建國;楊子剛;劉鵬;賴毓霄;張歡;黃靜歡;常廣濤;彭榮;stefan GRAETER;吳林波;張俊川;;可降解聚酯高分子多孔支架在潮濕環(huán)境下的力學性能和降解規(guī)律的研究[A];2006年上海市醫(yī)用生物材料研討會論文匯編[C];2006年

8 周汝毅;陸沖;程樹軍;李勇鋒;;乳酸接枝改性淀粉／聚乳酸共混物的制備[A];2006年全國高分子材料科學與工程研討會論文集[C];2006年

9 龔志云;徐志飛;秦雄;段亮;趙學維;王文祖;;生物可降解人工胸壁重建胸壁的實驗研究[A];中華醫(yī)學會第六次全國胸心血管外科學術會議論文集（胸外科分冊）[C];2006年

10 裴香玲;余四九;岳海寧;;恩諾沙星生物可降解聚合物聚乳酸-聚三亞甲基碳酸酯的體內外降解和釋藥實驗研究(簡報)[A];中國畜牧獸醫(yī)學會小動物醫(yī)學分會第四次學術研討會、中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)外科學分會第十六次學術研討會論文集（2）[C];2009年

相關重要報紙文章 前10條

1 塑訊;成本過高使可降解塑料袋難推行[N];中國包裝報;2011年

2 中環(huán);變廢為寶 資源再用[N];中國包裝報;2004年

3 陳達;節(jié)能減排“硬戰(zhàn)” 與本土創(chuàng)新之痛[N];第一財經(jīng)日報;2007年

4 本報記者 王麗好邋本報實習生 郁晶陶;垃圾袋,誰來保證可降解[N];解放日報;2008年

5 馬福升;強制推行環(huán)保產(chǎn)品體現(xiàn)綠色奧運精神[N];中國企業(yè)報;2007年

6 記者 王新顏;商業(yè)“禁塑令”帶來新商機[N];商務時報;2008年

7 陳鐵;湖北武漢啟動環(huán)保塑料袋工程[N];中國質量報;2008年

8 汪文 王生;玉米淀粉降解材料設備達到國際水平[N];中國包裝報;2008年

9 本報記者 陳湘靜;禁而不止不如有效利用[N];中國環(huán)境報;2009年

10 辛京;環(huán)保餐具要上奧運餐桌[N];中國環(huán)境報;2006年

相關博士學位論文 前10條

1 朱兆金;骨科新型醫(yī)用可降解植入材料JDBM鎂合金的生物毒性、髓內針及植入物感染細菌生物膜的基礎研究[D];蘇州大學;2013年

2 劉坤;可降解內支架法腸吻合術隔絕生物應力并促進吻合口愈合的體內外實驗研究[D];浙江大學;2012年

3 賈金鵬;形狀記憶可降解股骨遠端骨水泥塞的研制[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2009年

4 白一冰;頸椎前路生物可降解內固定系統(tǒng)的初步研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2006年

5 阮長順;新型骨修復材料可降解哌嗪基聚氨酯脲的研究[D];重慶大學;2011年

6 陳元維;組織工程支架材料及其降解產(chǎn)物血管化功能的體外研究及表征方法的建立[D];四川大學;2007年

7 陸浩翔;含氨基酸的生物醫(yī)用可降解聚氨酯的合成與性能研究[D];上海交通大學;2012年

8 張超紀;小口徑組織工程化血管模型的實驗研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2004年

9 王一帆;可降解內支架結腸吻合技術及其在特殊腹腔環(huán)境中應用的研究[D];浙江大學;2008年

10 于金海;應用新型可降解材料修復大鼠腹壁缺損的實驗研究[D];吉林大學;2010年

相關碩士學位論文 前10條

1 辛魯波;改性劑對大豆蛋白可降解材料性能的影響[D];中國石油大學;2010年

2 劉海蓉;聚ε-己內酯-co-L-丙交酯型可降解聚氨酯材料合成研究[D];北京化工大學;2011年

3 孫勇;熱塑性殼寡糖基可降解生物醫(yī)用復合材料的制備及性能研究[D];沈陽工業(yè)大學;2013年

4 劉伯業(yè);輻照改性大豆分離蛋白/淀粉可降解材料的研究[D];河南工業(yè)大學;2012年

5 侯紅江;改性大豆分離蛋白可降解材料研制及其降解性研究[D];河南工業(yè)大學;2010年

6 張萬靈;可降解管道支架的紡織參數(shù)對其徑向壓縮性能的影響[D];東華大學;2012年

7 宋強;螺旋形可降解輸尿管支架的實驗研究[D];山東師范大學;2009年

8 修凱華;生物可降解PLLA在接骨板內固定系統(tǒng)可行性應用的生物力學研究[D];四川大學;2005年

9 宗陽;可降解骨內植入材料用鎂合金JDBM表面改性的研究[D];上海交通大學;2011年

10 王萬富;新型納米羥基磷灰石/異種脫蛋白松質骨/Ⅰ型膠原復合型生物多孔可降解支架的制備及修復兔橈骨缺損的實驗研究[D];山西醫(yī)科大學;2011年

本文編號：2305618