【摘要】：研究背景：頭面部軟骨缺損是整形外科常見的疾病,采用組織工程技術(shù)修復(fù)頭面部軟骨缺損具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。然而,這項(xiàng)技術(shù)至今并未真正應(yīng)用于臨床,主要瓶頸在于工程化軟骨在具有完整免疫力的大動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建穩(wěn)定性很低并無法長期存活。究其原因,構(gòu)建軟骨最常用的PGA/PLA支架材料在體內(nèi)快速降解引起的無菌性炎癥反應(yīng)是干擾大動(dòng)物體內(nèi)軟骨再生的主要原因,并且這是一種以巨噬細(xì)胞參與為主的固有免疫反應(yīng)。因此,解決問題的關(guān)鍵在于如何有效地抵抗或避免這種以巨噬細(xì)胞參與為主的固有免疫反應(yīng)。首先,大量文獻(xiàn)報(bào)道,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)除具備基本的干性和低免疫原性外,還對(duì)機(jī)體多種免疫細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。那么,由BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨是否具有抑制以巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng),從而改善其在大動(dòng)物體內(nèi)的形成質(zhì)量需要進(jìn)一步探索；此外,優(yōu)化體外構(gòu)建技術(shù),通過延長體外培養(yǎng)時(shí)間促進(jìn)PGA/PLA的降解,或單純應(yīng)用軟骨細(xì)胞的方式構(gòu)建軟骨以避免材料引起的炎癥反應(yīng),是否能有效改善工程化軟骨在大動(dòng)物體內(nèi)的組織形成也需要進(jìn)一步探索。研究目的：1.明確不同種子細(xì)胞及應(yīng)用方案在大動(dòng)物皮下的構(gòu)建效果2.明確基于BMSCs構(gòu)建的組織工程軟骨對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用,并探討其相關(guān)機(jī)制。3.明確PGA/PLA體外殘留量對(duì)工程化軟骨在大動(dòng)物皮下軟骨形成的影響4.明確應(yīng)用單純軟骨細(xì)胞膜片構(gòu)建的軟骨在大動(dòng)物皮下的組織形成質(zhì)量研究方法和結(jié)果：1.基于PGA/PLA的組織工程軟骨在大動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建穩(wěn)定性的研究1.1 不同種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程軟骨在大動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)歸的研究方法：將豬耳廓軟骨細(xì)胞、BMSCs以及兩者1：1混合分別接種至PGA/PLA支架材料構(gòu)建工程化軟骨,體外培養(yǎng)8周后取材,首先進(jìn)行組織學(xué)、生物學(xué)及生物力學(xué)檢測(cè),并回植入豬自體皮下,規(guī)定時(shí)間內(nèi)取材,比較不同時(shí)期三者在豬自體皮下軟骨形成質(zhì)量及炎癥反應(yīng)。結(jié)果：豬耳廓軟骨細(xì)胞、BMSCs以及1：1混合復(fù)合PGA/PLA支架,體外培養(yǎng)8周后均能形成良好的軟骨組織,組織學(xué)、總膠原及楊氏模量方面無明顯差異。將三者植入豬自體皮下后2周,BMSCs組維持了完整的軟骨結(jié)構(gòu),1：1組和軟骨細(xì)胞組均遭到不同程度的破壞；體內(nèi)植入后8周,BMSCs組仍可見部分軟骨組織,1：1和軟骨細(xì)胞組遭到嚴(yán)重破壞。1.2 BMSCs構(gòu)建的組織工程軟骨對(duì)巨噬細(xì)胞極化作用的研究方法：耳廓軟骨細(xì)胞、BMSCs以及1：1混合復(fù)合PGA/PLA支架,以單純PGA/PLA支架為對(duì)照,體外培養(yǎng)8周后植入豬自體皮下,定期取材,比較各組體內(nèi)多核異物巨細(xì)胞數(shù)量以及巨噬細(xì)胞CD68和CD206的表達(dá)。同時(shí),將上述三組體外培養(yǎng)8周后的工程化軟骨與激活的巨噬細(xì)胞以transwell勺方式共培養(yǎng)24小時(shí),采用免疫熒光、Real time PCR、Elisa等方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞免疫表型的改變。結(jié)果：多核異物巨細(xì)胞和CD68陽性巨噬細(xì)胞在BMSCs組浸潤最少,PGA/PLA支架組最高,1：1和軟骨細(xì)胞組無明顯差異；M2型巨噬細(xì)胞特異表面標(biāo)志CD206在BMSCs組表達(dá)最高,PGA/PLA支架組最低。體外共培養(yǎng)模型進(jìn)一步驗(yàn)證BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后高表達(dá)CD206、IL-10、Arg-1等抗炎因子,低表達(dá)IL-1β和TNF-α等促炎因子,提示BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化的作用。1.3 PGA/PLA殘留量對(duì)工程化軟骨在大動(dòng)物體內(nèi)軟骨形成的影響方法：分別以軟骨細(xì)胞和BMSCs為種子細(xì)胞復(fù)合PGA/PLA,體外培養(yǎng)8周、12周、16周,比較體外培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)形成的工程化軟骨在組織學(xué)、生物學(xué)水平的差異,并計(jì)算體外PGA/PLA殘留量、殘留PGA直徑。對(duì)比體外培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)后植入豬自體皮下2周、8周所對(duì)應(yīng)的軟骨形成及炎癥反應(yīng)。結(jié)果：分別應(yīng)用軟骨細(xì)胞和BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨延長體外培養(yǎng)時(shí)間,可見PGA/PLA殘留量逐漸減少,殘留PGA直徑逐漸變細(xì),植入豬自體皮下后2周,體外12周和16周組軟骨形成均較體外8周組好,但在植入后8周,各組工程化軟骨均遭到破壞。不同培養(yǎng)時(shí)間的BMSCs組在植入后2周均維持了完整的軟骨形態(tài),但體外12周和16周組在體內(nèi)軟骨形成厚度明顯大于8周組。2.應(yīng)用單純軟骨細(xì)胞膜片在大動(dòng)物體內(nèi)再生軟骨組織的研究方法：將P3代豬耳廓軟骨細(xì)胞以超高密度“細(xì)胞堆積”的方法形成軟骨細(xì)胞膜片,體外培養(yǎng)12周,組織學(xué)檢測(cè)膜片形成質(zhì)量,并植入豬自體皮下,觀察植入后2周、8周、24周再生軟骨的形成情況。結(jié)果：軟骨細(xì)胞通過超高密度“細(xì)胞堆積”的方法可以在體外形成均質(zhì)的和具有一定厚度的軟骨細(xì)胞膜片,植入豬自體皮下后未見明顯炎癥反應(yīng),軟骨細(xì)胞膜片逐漸成熟并能長期存活,體內(nèi)24周組織學(xué)結(jié)構(gòu)與正常軟骨組織相似。研究結(jié)論：1.單純耳廓軟骨細(xì)胞、BMSCs、以及耳廓軟骨細(xì)胞與BMSCs (1:1)復(fù)合PGA/PLA支架材料在成軟骨誘導(dǎo)液作用下體外培養(yǎng)8周均能構(gòu)建出優(yōu)質(zhì)的軟骨組織,將三組工程化軟骨植入豬自體皮下,僅BMSCs組在植入后2周維持了完整的軟骨結(jié)構(gòu)。2.基于BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨具有促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化從而抑制炎癥反應(yīng),改善工程化軟骨在大動(dòng)物皮下的組織形成質(zhì)量。同時(shí),通過體外共培養(yǎng)模型進(jìn)一步驗(yàn)證BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨是通過促進(jìn)CD206、IL-10、Arg-1等抗炎因子的合成,降低IL-1β和TNF-α等促炎因子的合成完成巨噬細(xì)胞M2型的極化。3.工程化軟骨在體外培養(yǎng)至16周,PGA仍不能完全降解。PGA/PLA體外殘留量會(huì)影響工程化軟骨在豬自體皮下早期的軟骨形成。體外培養(yǎng)時(shí)間越長,PGA/PLA殘留量越少,體內(nèi)2周的軟骨形成越好。4.軟骨細(xì)胞膜片因不含外源性材料,避免了材料引起的炎癥反應(yīng)對(duì)軟骨形成的影響,植入豬自體皮下后可形成均質(zhì)、成熟的軟骨組織,并可長期存活。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R318.08;R622

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孔清泉,楊志明,項(xiàng)舟,羅靜聰;離心力在體外構(gòu)建組織工程軟骨中的作用[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2005年03期

2 王建,周躍;組織工程軟骨研究進(jìn)展[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2001年06期

3 胡洪亮,曹誼林,劉德莉,胡曉潔,崔磊,劉偉,商慶新;增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)在同種異體組織工程軟骨構(gòu)建中的示蹤作用[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2002年05期

4 荊鑫;組織工程軟骨構(gòu)建的研究現(xiàn)狀[J];實(shí)用骨科雜志;2002年03期

5 張英;周廣東;殷德民;;組織工程軟骨體外構(gòu)建的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[J];組織工程與重建外科雜志;2005年03期

6 范衛(wèi)民;蔡俊;;周期性壓力對(duì)組織工程軟骨的影響及其作用機(jī)制[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2006年08期

7 ;學(xué)科新聞:美國科學(xué)家研制出一種可用于注射用的組織工程軟骨[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年28期

8 楊東翔;元香南;孔戰(zhàn);陳旭;張傳輝;李建軍;;組織工程軟骨的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J];山東醫(yī)藥;2011年40期

9 王建,楊志明,周躍;離心管內(nèi)組織工程軟骨培養(yǎng)的初步研究[J];骨與關(guān)節(jié)損傷雜志;2003年02期

10 張廣程;范衛(wèi)民;馬益民;岳海濤;劉瑞平;;不同頻率周期性壓力對(duì)組織工程軟骨的影響[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2007年06期

相關(guān)會(huì)議論文 前5條

1 毛艷;張西正;李瑞欣;郭勇;陳旭義;;壓應(yīng)變作用下組織工程軟骨的構(gòu)建[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)2007年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2007年

2 陳康;王大平;;組織工程軟骨修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷研究新進(jìn)展[A];第20屆中國康協(xié)肢殘康復(fù)學(xué)術(shù)年會(huì)論文選集[C];2011年

3 高博;孔清泉;項(xiàng)舟;楊志明;羅靜聰;李秀群;;以脫細(xì)胞牛軟骨基質(zhì)為支架體外構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究[A];第20屆中國康協(xié)肢殘康復(fù)學(xué)術(shù)年會(huì)論文選集[C];2011年

4 毛艷;張西正;李瑞欣;郭勇;陳旭義;;壓應(yīng)變作用下組織工程軟骨的構(gòu)建[A];第八屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

5 王正輝;吳保俊;許珉;馬偉軍;;殼聚糖/明膠復(fù)合不同軟骨細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程軟骨的研究[A];2010全國耳鼻咽喉頭頸外科中青年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 本報(bào)記者 王丹　通訊員 羅國金;組織工程軟骨 關(guān)節(jié)修復(fù)的點(diǎn)睛之筆[N];健康報(bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 丁金萍;組織工程軟骨在大動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建穩(wěn)定性的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

2 馬益民;應(yīng)用周期性應(yīng)力場(chǎng)培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2008年

3 姜疆;在體構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2012年

4 郭寶鋒;人脂肪干細(xì)胞體內(nèi)外構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2008年

5 孔清泉;體外構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2005年

6 張浚睿;基于細(xì)胞膜片技術(shù)體外構(gòu)建組織工程軟骨[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

7 王光輝;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞三維定向誘導(dǎo)和體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的初步實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2005年

8 蔣淳;應(yīng)用微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2005年

9 曲福軍;轉(zhuǎn)BMP7基因組織工程軟骨的構(gòu)建與移植修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損[D];吉林大學(xué);2005年

10 楊強(qiáng);以軟骨細(xì)胞外基質(zhì)為基礎(chǔ)構(gòu)建組織工程軟骨以及骨軟骨復(fù)合體的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 岳海濤;不同強(qiáng)度周期性壓力對(duì)組織工程軟骨的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2007年

2 蔡俊;循環(huán)壓力對(duì)體外構(gòu)建組織工程軟骨的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2006年

3 盛英俊;不同持續(xù)時(shí)間的周期性壓力對(duì)構(gòu)建組織工程軟骨的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2009年

4 張廣程;不同頻率周期性壓力對(duì)組織工程軟骨的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2007年

5 朱君;富含血小板血漿聯(lián)合細(xì)胞膜片技術(shù)構(gòu)建可注射組織工程軟骨[D];西北大學(xué);2012年

6 李殿威;體外間歇性壓應(yīng)力對(duì)組織工程軟骨生物學(xué)作用的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

7 高峰;應(yīng)用旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器體外構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2008年

8 李文康;組織工程軟骨體外培養(yǎng)與調(diào)控系統(tǒng)開發(fā)[D];杭州電子科技大學(xué);2014年

9 祁偉;采用不同種植技術(shù)構(gòu)建組織工程軟骨和組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

10 吳鳳麟;堿性成纖維細(xì)胞生長因子與膠原對(duì)組織工程軟骨體外構(gòu)建的影響[D];暨南大學(xué);2005年

，

本文編號(hào)：2305496