【摘要】：研究背景：頭面部軟骨缺損是整形外科常見的疾病,采用組織工程技術(shù)修復(fù)頭面部軟骨缺損具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。然而,這項技術(shù)至今并未真正應(yīng)用于臨床,主要瓶頸在于工程化軟骨在具有完整免疫力的大動物體內(nèi)構(gòu)建穩(wěn)定性很低并無法長期存活。究其原因,構(gòu)建軟骨最常用的PGA/PLA支架材料在體內(nèi)快速降解引起的無菌性炎癥反應(yīng)是干擾大動物體內(nèi)軟骨再生的主要原因,并且這是一種以巨噬細(xì)胞參與為主的固有免疫反應(yīng)。因此,解決問題的關(guān)鍵在于如何有效地抵抗或避免這種以巨噬細(xì)胞參與為主的固有免疫反應(yīng)。首先,大量文獻(xiàn)報道,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)除具備基本的干性和低免疫原性外,還對機(jī)體多種免疫細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。那么,由BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨是否具有抑制以巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng),從而改善其在大動物體內(nèi)的形成質(zhì)量需要進(jìn)一步探索；此外,優(yōu)化體外構(gòu)建技術(shù),通過延長體外培養(yǎng)時間促進(jìn)PGA/PLA的降解,或單純應(yīng)用軟骨細(xì)胞的方式構(gòu)建軟骨以避免材料引起的炎癥反應(yīng),是否能有效改善工程化軟骨在大動物體內(nèi)的組織形成也需要進(jìn)一步探索。研究目的：1.明確不同種子細(xì)胞及應(yīng)用方案在大動物皮下的構(gòu)建效果2.明確基于BMSCs構(gòu)建的組織工程軟骨對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用,并探討其相關(guān)機(jī)制。3.明確PGA/PLA體外殘留量對工程化軟骨在大動物皮下軟骨形成的影響4.明確應(yīng)用單純軟骨細(xì)胞膜片構(gòu)建的軟骨在大動物皮下的組織形成質(zhì)量研究方法和結(jié)果：1.基于PGA/PLA的組織工程軟骨在大動物體內(nèi)構(gòu)建穩(wěn)定性的研究1.1 不同種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程軟骨在大動物體內(nèi)轉(zhuǎn)歸的研究方法：將豬耳廓軟骨細(xì)胞、BMSCs以及兩者1：1混合分別接種至PGA/PLA支架材料構(gòu)建工程化軟骨,體外培養(yǎng)8周后取材,首先進(jìn)行組織學(xué)、生物學(xué)及生物力學(xué)檢測,并回植入豬自體皮下,規(guī)定時間內(nèi)取材,比較不同時期三者在豬自體皮下軟骨形成質(zhì)量及炎癥反應(yīng)。結(jié)果：豬耳廓軟骨細(xì)胞、BMSCs以及1：1混合復(fù)合PGA/PLA支架,體外培養(yǎng)8周后均能形成良好的軟骨組織,組織學(xué)、總膠原及楊氏模量方面無明顯差異。將三者植入豬自體皮下后2周,BMSCs組維持了完整的軟骨結(jié)構(gòu),1：1組和軟骨細(xì)胞組均遭到不同程度的破壞；體內(nèi)植入后8周,BMSCs組仍可見部分軟骨組織,1：1和軟骨細(xì)胞組遭到嚴(yán)重破壞。1.2 BMSCs構(gòu)建的組織工程軟骨對巨噬細(xì)胞極化作用的研究方法：耳廓軟骨細(xì)胞、BMSCs以及1：1混合復(fù)合PGA/PLA支架,以單純PGA/PLA支架為對照,體外培養(yǎng)8周后植入豬自體皮下,定期取材,比較各組體內(nèi)多核異物巨細(xì)胞數(shù)量以及巨噬細(xì)胞CD68和CD206的表達(dá)。同時,將上述三組體外培養(yǎng)8周后的工程化軟骨與激活的巨噬細(xì)胞以transwell勺方式共培養(yǎng)24小時,采用免疫熒光、Real time PCR、Elisa等方法檢測巨噬細(xì)胞免疫表型的改變。結(jié)果：多核異物巨細(xì)胞和CD68陽性巨噬細(xì)胞在BMSCs組浸潤最少,PGA/PLA支架組最高,1：1和軟骨細(xì)胞組無明顯差異；M2型巨噬細(xì)胞特異表面標(biāo)志CD206在BMSCs組表達(dá)最高,PGA/PLA支架組最低。體外共培養(yǎng)模型進(jìn)一步驗證BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后高表達(dá)CD206、IL-10、Arg-1等抗炎因子,低表達(dá)IL-1β和TNF-α等促炎因子,提示BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化的作用。1.3 PGA/PLA殘留量對工程化軟骨在大動物體內(nèi)軟骨形成的影響方法：分別以軟骨細(xì)胞和BMSCs為種子細(xì)胞復(fù)合PGA/PLA,體外培養(yǎng)8周、12周、16周,比較體外培養(yǎng)不同時間點形成的工程化軟骨在組織學(xué)、生物學(xué)水平的差異,并計算體外PGA/PLA殘留量、殘留PGA直徑。對比體外培養(yǎng)不同時間點后植入豬自體皮下2周、8周所對應(yīng)的軟骨形成及炎癥反應(yīng)。結(jié)果：分別應(yīng)用軟骨細(xì)胞和BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨延長體外培養(yǎng)時間,可見PGA/PLA殘留量逐漸減少,殘留PGA直徑逐漸變細(xì),植入豬自體皮下后2周,體外12周和16周組軟骨形成均較體外8周組好,但在植入后8周,各組工程化軟骨均遭到破壞。不同培養(yǎng)時間的BMSCs組在植入后2周均維持了完整的軟骨形態(tài),但體外12周和16周組在體內(nèi)軟骨形成厚度明顯大于8周組。2.應(yīng)用單純軟骨細(xì)胞膜片在大動物體內(nèi)再生軟骨組織的研究方法：將P3代豬耳廓軟骨細(xì)胞以超高密度“細(xì)胞堆積”的方法形成軟骨細(xì)胞膜片,體外培養(yǎng)12周,組織學(xué)檢測膜片形成質(zhì)量,并植入豬自體皮下,觀察植入后2周、8周、24周再生軟骨的形成情況。結(jié)果：軟骨細(xì)胞通過超高密度“細(xì)胞堆積”的方法可以在體外形成均質(zhì)的和具有一定厚度的軟骨細(xì)胞膜片,植入豬自體皮下后未見明顯炎癥反應(yīng),軟骨細(xì)胞膜片逐漸成熟并能長期存活,體內(nèi)24周組織學(xué)結(jié)構(gòu)與正常軟骨組織相似。研究結(jié)論：1.單純耳廓軟骨細(xì)胞、BMSCs、以及耳廓軟骨細(xì)胞與BMSCs (1:1)復(fù)合PGA/PLA支架材料在成軟骨誘導(dǎo)液作用下體外培養(yǎng)8周均能構(gòu)建出優(yōu)質(zhì)的軟骨組織,將三組工程化軟骨植入豬自體皮下,僅BMSCs組在植入后2周維持了完整的軟骨結(jié)構(gòu)。2.基于BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨具有促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化從而抑制炎癥反應(yīng),改善工程化軟骨在大動物皮下的組織形成質(zhì)量。同時,通過體外共培養(yǎng)模型進(jìn)一步驗證BMSCs構(gòu)建的工程化軟骨是通過促進(jìn)CD206、IL-10、Arg-1等抗炎因子的合成,降低IL-1β和TNF-α等促炎因子的合成完成巨噬細(xì)胞M2型的極化。3.工程化軟骨在體外培養(yǎng)至16周,PGA仍不能完全降解。PGA/PLA體外殘留量會影響工程化軟骨在豬自體皮下早期的軟骨形成。體外培養(yǎng)時間越長,PGA/PLA殘留量越少,體內(nèi)2周的軟骨形成越好。4.軟骨細(xì)胞膜片因不含外源性材料,避免了材料引起的炎癥反應(yīng)對軟骨形成的影響,植入豬自體皮下后可形成均質(zhì)、成熟的軟骨組織,并可長期存活。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R622

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本文編號：2305496