【摘要】：心血管疾病已成為威脅人類健康的首要殺手,其致死率達40%。為有效防治心血管疾病,較多采用外科移植,用人工血管替換病變部位的血管。目前,大中口徑血管移植取得了較好的臨床效果,遠期通暢較為理想,而小口徑人工血管的移植成功率較低,至今仍制約其發(fā)展。造成小口徑人工血管移植失敗的因素很多,主要是材料的綜合性能與宿主血管不匹配。如何制備性能優(yōu)良的小口徑人工血管材料是小口徑人工血管研究中的熱點和難點。此外,小口徑人工血管生物相容性研究較為單一,目前國內鮮有報道動態(tài)條件下細胞在材料上的生長。實驗室中主要集中在靜態(tài)條件下,對細胞與材料之間相容性進行評價,以此判定材料生物相容性,缺乏對動態(tài)情況下細胞與材料表面相互作用,生長狀態(tài)的探索。往往導致材料雖然在靜態(tài)下生物相容性良好,一旦植入體內處于動態(tài)環(huán)境中,移植容易失敗。針對小口徑人工血管的這些難點,本論文采用蠶絲為原料,通過脫膠、溶解等工藝,制備生物相容性優(yōu)良的中分子量再生絲素蛋白,并對脫膠后真絲材料表面進行層層自組裝改性,以期能夠一定程度上解決這些問題。本研究主要圍繞以下4個部分進行:(1)制備中分子量再生絲素蛋白。中分子量絲素蛋白溶解性和成膜性適中,利于自組裝表面改性。采用0.5wt%碳酸鈉水溶液和8m尿素水溶液分別對蠶絲進行脫膠,通過苦味酸胭脂紅染色、計算失重率以及掃描電鏡觀察等方法評價蠶絲脫膠效果。選用9.3m溴化鋰水溶液和摩爾比為1:2:8的氯化鈣-乙醇-水三元溶液分別溶解脫膠后的絲素蛋白纖維。利用sds-page凝膠電泳對最終獲得的再生絲素蛋白的分子量及其分布進行分析測定,篩選出能夠獲得中分子量再生絲素蛋白的脫膠、溶解工藝;(2)層層自組裝改性真絲小口徑人工血管材料,并對其物理性能、生物相容性進行評價。絲膠殘留可能會引起炎性反應,脫膠后的真絲小口徑人工血管材料仍有小部分絲膠殘留。通過層層自組裝的方法,以中分子量再生絲素蛋白溶液和海藻酸鈉溶液作為聚電解質進行表面組裝改性能將表面絲膠包覆在里面,并利用75%乙醇溶液使絲素蛋白二級結構向穩(wěn)定狀態(tài)轉變,起到固定絲素蛋白的作用。同時,對層層自組裝后的材料表面形貌、力學性能、穩(wěn)定性、細胞相容性、血液相容性進行了較系統(tǒng)的測試;(3)建立體外動態(tài)培養(yǎng)體系,分析流體剪切力對細胞在改性材料上的生長影響�，F(xiàn)有動態(tài)培養(yǎng)裝置大多用于組織工程培養(yǎng),針對組織工程支架進行動態(tài)培養(yǎng),不適用于人工血管材料。本課題設計了一種簡便的、適用于人工血管材料表面細胞動態(tài)培養(yǎng)的裝置,在材料表面產生模擬血液流動的流體,并且通過調節(jié)入口流速實現(xiàn)剪切力可控,從而有效實現(xiàn)體外動態(tài)條件下研究細胞在材料上的生長情況,真實地模擬試樣植入體內后所處的環(huán)境;(4)一體成型管狀真絲小口徑人工血管并進行改性處理,研究其動態(tài)順應性。利用一體成型管狀織物的技術,織造直徑為6mm的管狀真絲小口徑人工血管。通過濕熱處理的方法進行熱定型,獲得結構均勻的三維管狀真絲小口徑人工血管。并通過脫膠、層層自組裝技術對其表面進行改性,以提高管狀真絲小口徑人工血管的生物相容性。同時,基于biodynamictestinstrument測試平臺,重點比較了改性管狀真絲小口徑人工血管、豬頸動脈以及其它參照人工血管的動態(tài)順應性。經過反復實驗,得出以下主要結論:(1)采用0.5%碳酸鈉對蠶絲脫膠1h,并用9.3m溴化鋰溶液在95℃條件下溶解絲素纖維,通過透析提純,能夠獲得中分子量再生絲素蛋白溶液,其分子量分布在20~100kda之間;(2)基于層層自組裝的研究理論,采用再生絲素蛋白溶液和海藻酸鈉溶液作為兩種聚電解質,調節(jié)溶液的ph值,獲得適宜組裝的聚電解質溶液。海藻酸鈉作為陰離子聚電解質,組裝時ph值調為8,此時zeta電位值為-35.75±0.81mv;再生絲素蛋白作為陽離子聚電解質,組裝時ph值調為2,此時zeta電位值為10.80±0.64mv;再生絲素蛋白作為陰離子聚電解質組裝最外層,組裝時ph值為8,zeta電位值為-9.23±0.46mv。此時,聚電解質溶液處于一般穩(wěn)定狀態(tài),不發(fā)生凝結,較適宜進行自組裝實驗;(3)層層自組裝能夠改善材料表面粗糙度,沉積物厚度隨之增厚。在組裝1.5層(bilayer,-/+)時,表面沉積了組裝物質,而且其表面較為粗糙,形成眾多突起,組裝膜的厚度為23nm;隨著組裝層數(shù)的增加,沉積物越積越多,組裝上去的物質分布變得均勻細膩,表面的突起變得越來越小,粗糙度顯著下降,厚度增長也越來越明顯。當組裝到9.5層時,已經形成較為光滑的表面,厚度達到215nm;(4)組裝后對試樣的穩(wěn)定性、機械性強度都略有提高。通過紅外光譜圖可以發(fā)現(xiàn),經過75%乙醇處理后,絲素蛋白的酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ處的特征峰發(fā)生偏移,表明處理后絲素蛋白由無規(guī)構象向β折疊構象轉換,形成穩(wěn)固的二級結構。熱重分析結果表明,乙醇溶液處理后的試樣熱分解時的峰值溫度從固定前的314.9℃增加到322.3℃,熱穩(wěn)定性輕微提升。經過24h流體切應力作用實驗,組裝膜能夠經受流體的作用而穩(wěn)定保持。隨著組裝層數(shù)的增加,頂破強度也不斷變大,組裝9.5層后試樣的頂破強度達到15.28±0.16n/mm2,與商用的聚四氟乙烯人工血管試樣(15.68±0.89n/mm2)相近,表明制備的試樣能夠達到體內使用的力學要求;(5)經過海藻酸鈉/再生絲素蛋白層層自組裝改性后,真絲小口徑人工血管材料細胞相容性、血液相容性均得到顯著改善。隨著組裝層數(shù)的增加,細胞在此材料上表現(xiàn)出較強的增殖能力,黏附細胞數(shù)量也增加。且隨著組裝層數(shù)增加到5.5層時,表面的細胞黏附越來越多,部分細胞鋪展良好,呈梭形生長。當組裝到9.5層時,經過一段時間培養(yǎng),細胞能夠在材料表面形成一層由細胞和細胞外基質組成的膜狀物。通過血液相容性實驗發(fā)現(xiàn),隨著組裝層數(shù)的增加,黏附在材料表面的血小板明顯減少,溶血現(xiàn)象也有改善。經過1.5層改性后,溶血率有所下降,當組裝3.5層及以上時,溶血率降至0.45%以下,根據(jù)astmf756-00標準所述,該材料達到不溶血的標準。組裝5.5層及以上時,表面無血小板黏附,展現(xiàn)出良好的抗血小板性;(6)通過流體模擬分析,獲得不同入口流速下底面剪切力值。在低流速作用下,液體處于自由流動狀態(tài),動態(tài)培養(yǎng)器中部剪切力發(fā)展不均勻,擾動較大,但隨著流速增加,動態(tài)培養(yǎng)器中部區(qū)域流體慢慢變得均勻。參照現(xiàn)有動態(tài)培養(yǎng)結論,本課題給細胞施加的剪切力分階段逐步增大,從3dyn/cm2開始,培養(yǎng)一段時間后剪切力值增加3dyn/cm2,最終達到正常的頸動脈剪切力值12dyn/cm2。經過觀察發(fā)現(xiàn),當纖維與流體平行時,細胞在流體作用下會沿著流體方向取向,且細胞被拉長,呈細長型;當纖維與流體垂直時,由于材料表面的結構導致細胞無法沿流體運動方向取向,細胞呈扁圓型;在經緯紗線交織點處,流體在此處作用力較小,內皮細胞聚集生長形成內皮細胞層;(7)管狀真絲小口徑人工血管改性前后動態(tài)順應性與生物血管尚有一定差距,后續(xù)有待進一步完善。實驗中選擇正弦波型,頻率1hz,測試50-90mmhg、80-120mmhg、110-150mmhg以及140-180mmhg四種壓力范圍下直徑的變化。選取四種直徑相近的血管(豬頸動脈、商用機織人工血管、波紋化針織人工血管以及聚四氟乙烯人工血管)作為參照樣。生物血管的動態(tài)順應性達到7.21%/100mmhg以上,明顯優(yōu)于人工血管的動態(tài)順應性(2.52%/100mmhg以下)。在三種人工血管中,波紋化的針織人工血管由于組織結構以及經過波紋化處理后,動態(tài)順應性比機織人工血管和聚四氟乙烯人工血管要好。而機織人工血管動態(tài)順應性略優(yōu)于聚四氟乙烯人工血管。真絲機織人工血管由于采用的紗線較粗,且初始模量要比滌綸高,因此成型后的管狀真絲小口徑人工血管動態(tài)順應性不如商用機織人工血管。同時,經過表面改性處理后,由于表面固定了一層絲素蛋白膜,使得試樣的動態(tài)順應性有所下降。綜上所述,通過中分子量再生絲素蛋白對真絲小口徑人工血管材料表面進行改性,不影響材料的基本性能,且能夠有效提升材料的細胞相容性和血液相容性,經過靜態(tài)以及體外動態(tài)細胞培養(yǎng),均能使細胞在材料表面粘附、增殖,改性后試樣的溶血率以及血小板黏附性均得到顯著改善。但制備的管狀真絲小口徑人工血管的動態(tài)順應性與生物血管的動態(tài)順應性尚有差距,需要在后續(xù)織造研究中著力解決。本課題為小口徑人工血管的研究奠定了一定的基礎。
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【學位授予單位】：東華大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R318.11

【參考文獻】

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本文編號：2292625