【摘要】：研究背景細(xì)胞是生命結(jié)構(gòu)和功能的基本單位,生物打印技術(shù)將細(xì)胞作為生物墨水打印構(gòu)建組織和器官,標(biāo)志著3D打印技術(shù)與生命科學(xué)的真正融合。與通常3D打印技術(shù)強(qiáng)調(diào)產(chǎn)品的制造精度和機(jī)械強(qiáng)度不同,生物打印技術(shù)更多的考慮的是細(xì)胞生物學(xué)表現(xiàn)。生物打印平臺的構(gòu)建、打印方案的設(shè)計(jì)和打印后產(chǎn)品的評價都圍繞著細(xì)胞展開。由于生命科學(xué)極端復(fù)雜、多變,人類對細(xì)胞的理解十分粗淺,有太多的未知等待著探索,即使在科技發(fā)展日新月異的今天,生物打印技術(shù)仍然處在萌芽階段,現(xiàn)階段生物打印技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用仍然屬于概念驗(yàn)證,距離實(shí)現(xiàn)具備生理功能的組織、器官的人工打印再造的目標(biāo)仍有很長的路要走。生物打印平臺的建立是實(shí)現(xiàn)生物制造的必要條件,亦是生物打印領(lǐng)域內(nèi)面臨諸多挑戰(zhàn)之一。生物打印機(jī)絕不是簡簡單單堆砌細(xì)胞和生物材料的裝置,打印平臺的建立代表了細(xì)胞生物學(xué)、生物材料學(xué)、自動控制、信息學(xué)等諸多學(xué)科高水平交叉綜合應(yīng)用的實(shí)力,體現(xiàn)了對生物打印核心技術(shù)的掌握。目前生物打印平臺的搭建技術(shù)并不成熟,根據(jù)打印的細(xì)胞、生物材料以及打印的目的不同,生物打印平臺構(gòu)建形式也多種多樣。世界上僅有少數(shù)幾個發(fā)達(dá)國家有能力開發(fā)商品化細(xì)胞生物打印機(jī),雖然這種生物打印機(jī)具有產(chǎn)品集成化程度高,操作簡便等優(yōu)點(diǎn),但由于打印材料有限,打印平臺軟硬件受專利保護(hù),無法根據(jù)打印實(shí)際需要進(jìn)行參數(shù)修改和軟硬件升級、優(yōu)化,商品化細(xì)胞生物打印機(jī)并未得到廣泛應(yīng)用。關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成,沒有血管、神經(jīng)和淋巴,幾乎沒有自我修復(fù)能力。一旦發(fā)生軟骨損傷往往導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能不可逆損害,最終引起骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。軟骨損傷修復(fù)尚無理想的治療手段,軟骨組織工程聯(lián)合應(yīng)用生命科學(xué)和工程制造的方法人工合成軟骨組織,是當(dāng)前最有希望解決軟骨缺損修復(fù)困境的方法。分層構(gòu)建組織工程軟骨是軟骨組織工程領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn),強(qiáng)調(diào)從結(jié)構(gòu)和功能上模擬天然軟骨分層變化的規(guī)律。在哺乳動物關(guān)節(jié)軟骨組織中,都存在著軟骨細(xì)胞密度由軟骨淺層至深層成梯度下降的分布規(guī)律,這是關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育和力學(xué)環(huán)境共同作用的結(jié)果,是關(guān)節(jié)軟骨重要的分層結(jié)構(gòu)特點(diǎn)之一。復(fù)習(xí)文獻(xiàn),國內(nèi)外尚無研究關(guān)注構(gòu)建具備仿生軟骨細(xì)胞密度梯度分布規(guī)律的組織工程軟骨。本研究期望自主建立擠壓式水凝膠細(xì)胞生物打印機(jī)驗(yàn)證平臺,初步掌握3D生物打印核心技術(shù),嘗試通過生物打印技術(shù)構(gòu)建具備仿生軟骨細(xì)胞密度梯度分布的組織工程軟骨,驗(yàn)證生物打印技術(shù)在軟骨組織工程中的應(yīng)用,觀察軟骨細(xì)胞密度梯度分布生物學(xué)作用,探索一種分層構(gòu)建組織工程軟骨的新策略。方法本研究利用開源軟硬件資料嘗試自主搭建擠壓式水凝膠生物打印驗(yàn)證平臺,硬件系統(tǒng)包括:Prusa i3三維打印機(jī)移動系統(tǒng),數(shù)控微量凝膠擠壓系統(tǒng);軟件應(yīng)用包括:三維電腦輔助設(shè)計(jì)軟件(CAD軟件)Solidworks、切片軟件Slic3r、打印機(jī)上位控制軟件Repetier-Host;選用3ml螺旋接口注射器作為水凝膠容器(生物打印墨水墨盒),25#平頭針頭作為擠壓成型噴頭,10%豬膝關(guān)節(jié)軟骨II型膠原蛋白鹽酸(0.15M)水溶膠作為打印墨水;安裝Prusa i3三維打印機(jī)移動系統(tǒng)和數(shù)控微量凝膠擠壓系統(tǒng)構(gòu)成擠壓式水凝膠生物打印驗(yàn)證平臺,使用Solidworks軟件設(shè)計(jì)三維實(shí)體模型,在切片軟件Slic3r中設(shè)置打印層厚、打印條帶走形方向及打印速度等參數(shù),分割三維實(shí)體模型生成連續(xù)的二維輪廓,生物打印機(jī)在生成的Gcode代碼文件控制下完成水凝膠打印,打印成型的II型膠原溶膠塊置于37℃孵箱內(nèi)30分鐘完成交聯(lián);本研究通過生物打印技術(shù)構(gòu)建具備仿生軟骨細(xì)胞密度梯度分布的組織工程軟骨,實(shí)驗(yàn)參考正常成人膝關(guān)節(jié)股骨髁軟骨中軟骨細(xì)胞總體密度約為1×107cell/m L,關(guān)節(jié)軟骨淺、中、深三層細(xì)胞密度之比約3:2:1,使用復(fù)合不同軟骨細(xì)胞密度的10%II型膠原蛋白水溶膠作為生物墨水,設(shè)計(jì)A組(細(xì)胞總體密度約為2×107cell/ml)、B組(細(xì)胞總體密度約為1×107cell/m L)、C組(細(xì)胞總體密度約為0.5×107cell/m L)三組組織工程軟骨,每組分別構(gòu)建具有仿生軟骨細(xì)胞密度梯度分布和細(xì)胞均勻分布的兩類細(xì)胞分布形式組織工程軟骨,體外培養(yǎng),分別于第0、1、2、3周取材,進(jìn)行細(xì)胞學(xué)、生化、組織學(xué)等相關(guān)檢測,對比分析仿生軟骨細(xì)胞密度梯度分布和細(xì)胞均勻分布的兩類組織工程軟骨,驗(yàn)證生物打印技術(shù),觀察仿生細(xì)胞密度梯度分布的生物學(xué)意義。結(jié)果擠壓式水凝膠生物3D打印驗(yàn)證平臺得到初步建立,擠壓頭與三維運(yùn)動系統(tǒng)匹配,系統(tǒng)運(yùn)行平穩(wěn),打印過程全程可控,通過優(yōu)化打印參數(shù),3D細(xì)胞生物打印過程對細(xì)胞活性無明顯影響;擠壓式水凝膠生物3D打印平臺能夠?qū)崿F(xiàn)仿生軟骨細(xì)胞密度梯度分布組織工程軟骨模型的構(gòu)建,組織工程軟骨體外培養(yǎng)3周,RT-q PCR結(jié)果顯示:組織工程軟骨中軟骨細(xì)胞基因COL1A1持續(xù)低水平表達(dá)且出現(xiàn)下調(diào)趨勢,基因COL2A1和ACAN表達(dá)水平隨培養(yǎng)時間延長呈上調(diào)趨勢,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;核酸定量法測定組織工程軟骨細(xì)胞總量結(jié)果顯示:各時間點(diǎn)A、B、C三組中兩類組織工程軟骨(細(xì)胞均勻分布組織塊與細(xì)胞梯度分布組織塊)細(xì)胞總量無統(tǒng)計(jì)差異,隨培養(yǎng)時間延長各組組織工程軟骨細(xì)胞總量均出現(xiàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降趨勢;組織工程軟骨樣本GAG定量結(jié)果顯示:體外培養(yǎng)第1周,A、B、C三組GAG總量與支架中細(xì)胞總體密度呈正相關(guān),A組GAG含量最高,C組最低;培養(yǎng)第2、3周,C組GAG總量仍然最低,A組和B組GAG含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,為評估單個細(xì)胞GAG合成活性,分別將各組GAG總量與細(xì)胞總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化處理,體外培養(yǎng)第1周,各組間單細(xì)胞GAG合成量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在第2、3周,A組單細(xì)胞GAG合成量最低,B組具有最高的單細(xì)胞GAG合成量,B組中兩類細(xì)胞分布組織塊單細(xì)胞GAG合成量無統(tǒng)計(jì)差異,但B組細(xì)胞密度梯度分布組織塊單細(xì)胞GAG合成量與A、C兩組有統(tǒng)計(jì)差異,培養(yǎng)第3周,B、C兩組中細(xì)胞均勻分布組織塊單細(xì)胞GAG合成量有統(tǒng)計(jì)差異;免疫組化染色及阿爾新蘭染色結(jié)果顯示:免疫組化陽性染色細(xì)胞呈棕黃色,免疫組化陰性染色細(xì)胞呈藍(lán)色,GAG成分被阿爾新蘭染成藍(lán)色,組織工程軟骨中絕大多數(shù)軟骨細(xì)胞表現(xiàn)為II型膠原蛋白陽性染色,一部分軟骨細(xì)胞表現(xiàn)為PRG4陽性,只有少數(shù)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)I型膠原陽性染色,細(xì)胞密度梯度組軟骨細(xì)胞新和成的II型膠原蛋白、PRG4和GAG成分呈現(xiàn)梯度分布規(guī)律,由淺層至深層逐漸減少。結(jié)論在熟悉并掌握生物3D打印相關(guān)基本原理和各系統(tǒng)軟硬件組成基礎(chǔ)之上,綜合應(yīng)用機(jī)械自動控制技術(shù)和生命科學(xué)理論,能夠根據(jù)具體生物墨水和實(shí)際打印需要,利用開源軟硬件資料自主設(shè)計(jì)并建立擠壓式水凝膠生物打印驗(yàn)證平臺,通過仿生細(xì)胞分布組織工程軟骨模型的建立,驗(yàn)證了擠壓式水凝膠生物打印驗(yàn)證平臺能夠?qū)崿F(xiàn)軟骨細(xì)胞在水凝膠支架中精確的空間定位,通過優(yōu)化支架中細(xì)胞種植密度和分布模式能夠提高細(xì)胞活性,研究結(jié)果表明生物打印仿生密度梯度分布組織工程軟骨是一種分層構(gòu)建組織工程軟骨的新策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R68
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本文編號：
2291959
