【摘要】：【目的】觀察運(yùn)用組織工程軟骨或BMNC(bone marrow mononuclear cell,骨髓單個(gè)核細(xì)胞)-PLGA(polylactic-co-glycolic acid,聚乳酸-羥基乙酸共聚物)復(fù)合物填補(bǔ)馬賽克手術(shù)(autologous osteochondral mosaicplasty)遺留空腔的修復(fù)效果�！痉椒ā�(1)實(shí)驗(yàn)分組:取18只7~8月齡骨骼成熟的實(shí)驗(yàn)用小型豬,共計(jì)36例膝關(guān)節(jié),隨機(jī)分為如下四組。①對(duì)照組:單純馬賽克手術(shù);②空白支架組:馬賽克手術(shù)+空腔通過無細(xì)胞的PLGA支架進(jìn)行填補(bǔ);③工程軟骨組:馬賽克手術(shù)+空腔通過體外構(gòu)建的組織工程軟骨進(jìn)行填補(bǔ);④復(fù)合物組:馬賽克手術(shù)+空腔通過體外構(gòu)建的BMNC-PLGA復(fù)合物進(jìn)行填補(bǔ)。(2)軟骨缺損模型的建立與組織工程移植物的構(gòu)建:在股骨內(nèi)髁負(fù)重區(qū)建立直徑為6 mm的軟骨缺損模型。工程軟骨組中,在制作缺損模型的同時(shí)獲取自體軟骨細(xì)胞,將擴(kuò)增的第2代軟骨細(xì)胞接種于PLGA支架,以構(gòu)建組織工程軟骨。復(fù)合物組中,在進(jìn)行馬賽克手術(shù)之前,使用選擇性細(xì)胞滯留技術(shù)從骨髓液中濃集BMNCs,并構(gòu)建BMNC-PLGA復(fù)合物。(3)軟骨缺損的修復(fù):首先采用馬賽克手術(shù)對(duì)軟骨缺損進(jìn)行基本修復(fù)。隨后,通過不同方法對(duì)馬賽克手術(shù)遺留的空腔進(jìn)行填補(bǔ)。①對(duì)照組:空腔不做處理;②空白支架組:使用無細(xì)胞的PLGA支架填補(bǔ)空腔;③工程軟骨組:使用體外構(gòu)建的組織工程軟骨填補(bǔ)空腔;④復(fù)合物組:使用體外構(gòu)建的BMNC-PLGA復(fù)合物填補(bǔ)空腔。(4)檢測(cè)指標(biāo):術(shù)后6個(gè)月,分別處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,獲取修復(fù)組織的樣本。通過大體觀察、組織學(xué)評(píng)估、MRI(magnetic resonance imaging,磁共振成像)、生物力學(xué)測(cè)試和GAG(glycosaminoglycan,糖胺多糖)含量測(cè)定等方面對(duì)軟骨缺損的修復(fù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)�！窘Y(jié)果】在大體觀察、組織學(xué)評(píng)估、MRI形態(tài)學(xué)評(píng)估和T2指數(shù)的比較中,工程軟骨組和復(fù)合物組的各項(xiàng)得分均明顯高于對(duì)照組和空白支架組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。對(duì)照組、空白支架組、工程軟骨組和復(fù)合物組的平均彈性模量分別為26.9 MPa、28.3 MPa、38.1 MPa和36.2 MPa;工程軟骨組和復(fù)合物組的彈性模量明顯高于對(duì)照組和空白支架組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。工程軟骨組和復(fù)合物組的GAG含量分別為10.81±0.79 mg/g和9.49±1.26 mg/g,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�！窘Y(jié)論】運(yùn)用組織工程軟骨填補(bǔ)馬賽克手術(shù)遺留的空腔可以取得理想的修復(fù)效果,但費(fèi)時(shí)、昂貴,且須分兩次手術(shù)完成。運(yùn)用BMNC-PLGA復(fù)合物填補(bǔ)馬賽克手術(shù)遺留的空腔也可取得較好的修復(fù)效果,是一種相對(duì)簡(jiǎn)單、便捷、經(jīng)濟(jì)的修復(fù)方法�！灸康摹砍醪教接懺诠才囵B(yǎng)系統(tǒng)中ACs(articular chondrocytes,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞)與BMSCs(bone marrow mesenchymal stem cells,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)之間的相互作用機(jī)制。【方法】共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)Ⅰ(1)實(shí)驗(yàn)分組:①單純培養(yǎng)的ACs;②單純培養(yǎng)的BMSCs;③間接接觸共培養(yǎng)的ACs;④間接接觸共培養(yǎng)的BMSCs;⑤直接接觸共培養(yǎng)的ACs和BMSCs的混合細(xì)胞;⑥間接接觸共培養(yǎng)的ACs和BMSCs的混合細(xì)胞。(2)實(shí)驗(yàn)流程:將大鼠的ACs與大鼠的BMSCs按2:1的比例分別進(jìn)行直接接觸和間接接觸兩種方式的共培養(yǎng),在第21天收集獲取上述六組樣本。(3)檢測(cè)指標(biāo):采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR(reverse transcript polymerase chain reaction,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和Western Blot檢測(cè)SOX9(SRY(sex determining region Y)-box 9,Y染色體性別決定區(qū)-HMG盒9)、COL2(TypeⅡCollagen,Ⅱ型膠原)、Aggrecan、COL10(TypeⅩCollagen,Ⅹ型膠原)和COL1(TypeⅠCollagen,Ⅰ型膠原)的表達(dá)變化。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)Ⅱ(1)實(shí)驗(yàn)分組:①單純培養(yǎng)的ACs;②單純培養(yǎng)的GFP(green fluorescent protein,綠色熒光蛋白)-BMSCs;③間接接觸共培養(yǎng)的ACs;④間接接觸共培養(yǎng)的GFP-BMSCs;⑤直接接觸共培養(yǎng)的ACs;⑥直接接觸共培養(yǎng)的GFP-BMSCs。(2)實(shí)驗(yàn)流程:將大鼠的ACs與轉(zhuǎn)基因大鼠的GFP-BMSCs按2:1的比例分別進(jìn)行直接接觸和間接接觸兩種方式的共培養(yǎng)。在第21天,通過流式細(xì)胞儀分選直接接觸共培養(yǎng)的ACs和GFP-BMSCs,并收集上述六組樣本。(3)檢測(cè)指標(biāo):采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western Blot檢測(cè)SOX9、COL2、Aggrecan、COL10和COL1的表達(dá)變化。【結(jié)果】與單純培養(yǎng)的ACs和BMSCs的表達(dá)量相比,經(jīng)過間接接觸和直接接觸兩種方式的共培養(yǎng)之后ACs與BMSCs的SOX9、COL2和Aggrecan的m RNA和蛋白表達(dá)量均明顯上調(diào)。經(jīng)過直接接觸共培養(yǎng)之后,ACs和BMSCs混合細(xì)胞的SOX9、COL2和Aggrecan的m RNA和蛋白表達(dá)量最高,并且明顯高于間接接觸共培養(yǎng)的ACs和BMSCs混合細(xì)胞的表達(dá)量。在SOX9、COL2及Aggrecan的m RNA和蛋白表達(dá)量方面,直接接觸共培養(yǎng)的ACs的表達(dá)量明顯高于間接接觸共培養(yǎng)的ACs的表達(dá)量;直接接觸共培養(yǎng)的BMSCs的表達(dá)量也明顯高于間接接觸共培養(yǎng)的BMSCs的表達(dá)量。在直接接觸和間接接觸兩種共培養(yǎng)方式中,BMSCs的SOX9、COL2和Aggrecan的m RNA和蛋白表達(dá)量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同一共培養(yǎng)系統(tǒng)中ACs的表達(dá)量,甚至仍低于單純培養(yǎng)的ACs的表達(dá)量。【結(jié)論】1.與ACs對(duì)BMSCs的誘導(dǎo)作用相比,BMSCs對(duì)ACs的促進(jìn)和支持對(duì)于增強(qiáng)軟骨基質(zhì)形成起著更加重要的作用。2.與可溶性因子的作用相比,直接物理接觸在共培養(yǎng)過程中起主導(dǎo)作用,至少是非常重要的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R687;R318.08

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本文編號(hào)：2279695