【摘要】：人角膜內(nèi)皮層（HCE）由單層的六角形人角膜內(nèi)皮細(xì)胞（HCE細(xì)胞）鑲嵌而成，是前房房水和角膜基質(zhì)之間的滲漏性屏障，HCE細(xì)胞質(zhì)膜上所擁有的諸多膜運(yùn)輸?shù)鞍淄ㄟ^發(fā)揮“泵”功能使整個(gè)角膜處于半脫水狀態(tài)，在維持角膜正常厚度和其透明性進(jìn)而保障眼睛發(fā)揮正常視功能方面具有不可替代的作用。遺憾的是，成人的HCE細(xì)胞喪失了增殖能力，而且數(shù)量還在逐年減少，HCE單層完整性的維持只能靠鄰近HCE細(xì)胞的擴(kuò)大和移行來實(shí)現(xiàn)。一旦受到病原體感染、機(jī)械損傷和非生理性脅迫等，HCE細(xì)胞死亡的速率更快，輕者會(huì)造成不可逆角膜病變——角膜內(nèi)皮功能失代償（corneal endothelial dysfunction），重者將會(huì)致盲——角膜內(nèi)皮盲（primary corneal endotheliopathy），角膜內(nèi)皮病盲在因角膜病變所導(dǎo)致的視力障礙中位于第二位。角膜移植是目前治療角膜內(nèi)皮病盲的唯一辦法，因HCE異常僅僅是由于HCE細(xì)胞數(shù)量不足造成的，，故絕大多數(shù)角膜內(nèi)皮病盲患者均可通過角膜移植而治愈，但由于捐獻(xiàn)角膜數(shù)量的高度匱乏，致使可用于角膜移植的供體角膜材料嚴(yán)重不足，眾多角膜內(nèi)皮病盲患者無法通過角膜移植重見光明。 目前，組織工程人角膜內(nèi)皮（tissue-engineered human corneal endothelium,TE-HCE）被公認(rèn)為是治療角膜內(nèi)皮病盲的天然HCE的等效替代物，已成為廣大角膜內(nèi)皮病盲患者恢復(fù)視力和復(fù)明的唯一希望。但迄今為止，仍沒有可用于臨床HCE移植的TE-HCE產(chǎn)品問世。本文在前期研究工作的基礎(chǔ)上，利用表型、核型和功能蛋白表達(dá)正常且沒有致瘤性的人角膜內(nèi)皮單克隆細(xì)胞株細(xì)胞（monoclonal human corneal endothelial cells, mcHCE細(xì)胞）為種子細(xì)胞，以理化性能正常、安全性高且生物相容性理想的薄化去上皮層修飾羊膜（modifieddenuded-epithelium amniotic membrane, mdAM）為載體支架，在體外重建出了形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)正常的TE-HCE，并利用家貓和獼猴進(jìn)行了動(dòng)物角膜的穿透性后板層角膜移植試驗(yàn)，旨在獲得可使移植動(dòng)物角膜長期維持透明的TE-HCE，為可用于臨床HCE移植的TE-HCE新產(chǎn)品的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 用于TE-HCE體外重建的種子細(xì)胞為來自非轉(zhuǎn)染無致瘤性HCE細(xì)胞系（utHCEC01）的第38代mcHCE細(xì)胞。在用作種子細(xì)胞開展TE-HCE體外重建之前，分別對(duì)其細(xì)胞屬性、功能蛋白的表達(dá)以及致瘤性進(jìn)行了檢測和鑒定。檢測結(jié)果顯示，第38代mcHCE細(xì)胞呈近似六角形的多邊形內(nèi)皮樣細(xì)胞形態(tài)，透明度高，形態(tài)大小均一，細(xì)胞群體倍增時(shí)間為41.07h，染色體數(shù)目為2n=46條，表明該細(xì)胞株細(xì)胞的生長狀態(tài)良好，分裂增殖能力旺盛；第38代mcHCE細(xì)胞仍維持有標(biāo)志蛋白——人血管內(nèi)皮生長因子受體-2（Flk1）和人IV型膠原蛋白的陽性表達(dá)，表明該細(xì)胞株細(xì)胞保持有HCE細(xì)胞的固有屬性；細(xì)胞連接蛋白的免疫熒光檢測結(jié)果顯示，第38代mcHCE細(xì)胞仍保持有緊密連接蛋白1（ZO-1）、N-鈣粘蛋白（N-Cadherin）、間隙連接蛋白-43（CX-43）和整聯(lián)蛋白αv/β5（Integrinαv/β5）的陽性表達(dá)，表明該細(xì)胞株細(xì)胞具有在細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間形成細(xì)胞連接的潛能；第38代mcHCE細(xì)胞還維持有細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)鞍住薔a+/K+ATPase、人氯離子通道蛋白-2（hCLCN2）、 Na+/HCO3-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（hSLC4）和人水孔通道蛋白-1（AQP1）的陽性表達(dá)，表明該細(xì)胞株細(xì)胞具有發(fā)揮正常膜運(yùn)輸功能的潛能；第38代mcHCE細(xì)胞在裸鼠皮下接種后沒有腫瘤出現(xiàn)，證實(shí)該細(xì)胞株細(xì)胞沒有致瘤性。綜合上述檢測和鑒定結(jié)果，證明第38代mcHCE細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、屬性和功能正常，且沒有致瘤性，可以被用作TE-HCE體外重建的種子細(xì)胞。 本文利用胰酶-EDTA倒置消化法對(duì)去上皮層羊膜進(jìn)行薄化處理，再使用專用信號(hào)分子包被，制得薄化mdAM。在用作載體支架進(jìn)行TE-HCE體外重建之前，分別對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)以及其與第38代mcHCE細(xì)胞的生物相容性進(jìn)行檢測和評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，薄化mdAM只有基底膜和致密層組成，且上皮面光滑平整；厚度均一，平均厚度約為28.47μm；透明度和透光率良好，可見光區(qū)的透光率在90%以上；重金屬含量符合國家對(duì)可吸收植入型醫(yī)用生物材料的要求。薄化mdAM無熱源和眼刺激性；皮下植入后無炎癥反應(yīng)且降解速度比瑞濟(jì)生物羊膜快；且與第38代mcHCE細(xì)胞具有良好的生物相容性。綜上所述，薄化mdAM具有良好的理化和生物學(xué)性能，安全性高，且與mcHCE細(xì)胞生物相容性良好，可以被用作TE-HCE體外重建的載體支架。 本文以上述mcHCE細(xì)胞為種子細(xì)胞、以薄化mdAM為載體支架，用含20%FBS的DMEM/F12(1:1)完全培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下進(jìn)行了TE-HCE的體外重建。每24h茜素紅染色結(jié)果顯示，重建96h后種子細(xì)胞便可在載體支架上形成完整連續(xù)的細(xì)胞層，細(xì)胞與細(xì)胞間著色清晰，細(xì)胞呈近似六角形內(nèi)皮樣形態(tài)，細(xì)胞密度為3487±99.04個(gè)/mm2；組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果顯示，體外重建96h所得的TE-HCE具有完整連續(xù)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞單層，多角形細(xì)胞中具有一定數(shù)量的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與載體支架間具有多處細(xì)胞連接樣結(jié)構(gòu)，與正常HCE的組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)相似。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，體外重建96h所得的TE-HCE仍維持有細(xì)胞緊密連接蛋白1（ZO-1）、N-鈣粘蛋白（N-Cadherin）、間隙連接蛋白-43（CX-43）和整聯(lián)蛋白αv/β5（Integrinαv/β5）的陽性表達(dá)，表明體外重建96h所得的TE-HCE具有形成緊密連接復(fù)合體進(jìn)而形成前房房水與角膜基質(zhì)間滲漏性屏障的潛能。綜上所述，體外重建96h所得TE-HCE具有與正常HCE相似的形態(tài)特征、組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)，可以作為正常HCE的等效替代物，被認(rèn)為可以用于角膜內(nèi)皮病盲的臨床治療。 為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)所重建的TE-HCE在體內(nèi)是否具有正常HCE的生理功能。本文選用自身角膜內(nèi)皮細(xì)胞沒有增殖能力的家貓和獼猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。首先撕除實(shí)驗(yàn)眼的后彈力層和內(nèi)皮層，然后進(jìn)行帶DiI熒光標(biāo)記的TE-HCE和mdAM（對(duì)照組）的后板層角膜移植。移植后用裂隙燈顯微鏡、角膜測厚儀和眼壓計(jì)跟蹤觀察其透明度、厚度和眼壓的變化情況，并在家貓移植104天，獼猴移植181天時(shí)取材進(jìn)行DiI熒光標(biāo)記、茜素紅染色及細(xì)胞密度、組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的離體鑒定，此外家貓還進(jìn)行了房水蛋白變化的鑒定。結(jié)果顯示，家貓和獼猴TE-HCE移植眼的角膜均未出現(xiàn)水腫和排斥等不良反應(yīng)，角膜厚度逐漸下降，并逐漸恢復(fù)透明；而mdAM實(shí)驗(yàn)眼，角膜水腫嚴(yán)重且不透明；但TE-HCE移植眼、mdAM移植眼和正常對(duì)照眼的眼壓在觀察期間均在上下波動(dòng)，沒有明顯的相關(guān)性。離體檢測結(jié)果顯示，家貓和獼猴TE-HCE移植眼角膜中央移植區(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞均帶有DiI熒光標(biāo)記，且形態(tài)大小均一，多為六角形鑲嵌內(nèi)皮樣形態(tài)，細(xì)胞密度分別為2573.33±0.59個(gè)/mm2和2780.00±0.77個(gè)/mm2，與他們各自正常對(duì)照眼的形態(tài)和細(xì)胞密度相近，而mdAM移植眼角膜中央移植區(qū)均沒有內(nèi)皮細(xì)胞，這表明，家貓和獼猴TE-HCE移植眼角膜中央移植區(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞均來自所植入的TE-HCE，且具有與正常對(duì)照眼相似的形態(tài)特征和細(xì)胞密度。家貓和獼猴TE-HCE移植眼角膜的組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)與正常對(duì)照眼角膜相似，但獼猴TE-HCE移植眼角膜在移植181天后HCE細(xì)胞仍沒有分泌形成新的后彈力層。家貓TE-HCE移植眼和正常對(duì)照眼房水蛋白的二維電泳的分析結(jié)果顯示，TE-HCE移植眼與正常對(duì)照眼房水蛋白分離斑點(diǎn)的重復(fù)性較好，匹配的Corr系數(shù)達(dá)到0.8以上。綜上所述，TE-HCE在家貓和獼猴體內(nèi)具有正常HCE的生理功能，能夠維持家貓和獼猴移植角膜的正常厚度和長期透明性。 綜上所述，利用表型、核型和功能蛋白表達(dá)正常且沒有致瘤性的mcHCE細(xì)胞為種子細(xì)胞，以理化性能正常、安全性高且生物相容性理想的薄化mdAM為載體支架，在體外重建96h后即可獲得形態(tài)特征和組織結(jié)構(gòu)近似正常HCE的TE-HCE，且移植到自身角膜內(nèi)皮細(xì)胞無增殖能力且撕除后彈力層和內(nèi)皮層的家貓和獼猴角膜上后，能夠重塑出形態(tài)特征、細(xì)胞密度、組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)與正常HCE基本一致的角膜內(nèi)皮細(xì)胞單層，且能夠維持家貓和獼猴移植角膜的正常厚度及長期透明性。這些研究結(jié)果表明該TE-HCE可以作為天然HCE的等效替代物，用于角膜內(nèi)皮病盲的臨床治療，為眾多角膜病盲患者重建光明帶來希望，這在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2260703