本文選題：RGD肽 + 氧化石墨烯��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)是石墨烯(Graphene,GN)的氧化衍生物,因具有豐富的含氧功能團(tuán)而易于表面功能化修飾,功能化的氧化石墨烯在生物傳感器的制造和骨組織工程的應(yīng)用正在擴(kuò)大。然而,當(dāng)前報(bào)道對(duì)氧化石墨烯的RGD肽功能化修飾需要引入第三種鏈接分子,不但增加了實(shí)驗(yàn)體系的復(fù)雜性,而且有可能改變氧化石墨烯自身的物理化學(xué)性能。因此,提供一種更為直接、簡(jiǎn)單的方法實(shí)現(xiàn)氧化石墨烯表面生物功能化,并研究其生物性能顯得很有必要。RGD肽也被稱為細(xì)胞粘附肽,能夠促進(jìn)細(xì)胞粘附、增殖和分化。RGD肽與GO的結(jié)合能否增強(qiáng)細(xì)胞的活性、能否作為細(xì)胞生物傳感器界面應(yīng)用于體外細(xì)胞學(xué)分析、能否應(yīng)用于骨組織工程,值得我們?nèi)パ芯刻剿�。目�?1、通過EDC/NHS耦合反應(yīng)將RGD肽共價(jià)修飾GO,合成一種新型的RGD-GO生物膜,并對(duì)其進(jìn)行表征;通過RGD-GO生物膜修飾ITO電極作為傳感電極,研究其在電化學(xué)生物傳感器的應(yīng)用;2、研究RGD-GO生物膜促進(jìn)C3H10T1/2干細(xì)胞體外成骨分化的能力;3、考察RGD-GO生物膜體內(nèi)生物相容性;4、研究RGD-GO生物膜復(fù)合c3h10t1/2干細(xì)胞裸鼠皮下異位成骨的能力,將其在骨組織工程中的應(yīng)用進(jìn)行初步的探索。方法:1、將go水溶液通過自然干燥形成go薄膜,通過edc/nhs耦合反應(yīng),將具有胺功能團(tuán)的rgd肽固定在go膜表面,形成rgd-go生物膜。原子力顯微鏡對(duì)修飾前后go表面進(jìn)行形貌學(xué)表征,傅里葉變換紅外光譜測(cè)量修飾前后go化學(xué)成分變化,接觸角測(cè)量?jī)x對(duì)合成材料的親疏水性進(jìn)行測(cè)量。同時(shí),rgd-go生物膜表面電化學(xué)性質(zhì)通過電化學(xué)阻抗譜(eis)進(jìn)行表征。2、分別在rgd-go生物膜/go膜上培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞(hpdlfs),cck8檢測(cè)比較細(xì)胞活力,激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架情況,通過imagej軟件(nih)分析細(xì)胞在兩種材料表面的粘附差異;將rgd-go生物膜修飾在ito電極表面,顯微鏡下觀察培養(yǎng)在rgd-go生物膜修飾的ito電極表面hpdlfs的生長(zhǎng)情況,通過電化學(xué)阻抗譜技術(shù)(eis)檢測(cè)和對(duì)比分析hpdlfs細(xì)胞在rgd-go生物膜/go膜修飾電極表面的增殖粘附行為,通過eis檢測(cè)脂多糖對(duì)hpdlfs細(xì)胞活力的影響,并以cck-8實(shí)驗(yàn)做為對(duì)照。3、以c3h10t1/2為干細(xì)胞模型,在rgd-go生物膜表面培養(yǎng)不同時(shí)間后,通過顯微鏡觀察材料表面細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)、激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架情況;通過檢測(cè)堿性磷酸酶活性、堿性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn)、茜素紅染色實(shí)驗(yàn)、熒光定量pcr檢測(cè)成骨相關(guān)基因opn、ocn、runx2的表達(dá),考察在rgd-go生物膜上培養(yǎng)的c3h10t1/2干細(xì)胞在未加成骨誘導(dǎo)因子的情況下成骨分化的能力;4、以臨床常用植骨材料bio-oss為對(duì)照、將rgd-go生物膜同期植入sd大鼠背部皮下,通過大體觀察和形態(tài)組織分析,對(duì)比研究rgd-go生物膜的體內(nèi)生物相容性;5、rgd-go生物膜復(fù)合c3h10t1/2干細(xì)胞植入裸鼠背部皮下,以臨床常用植骨材料bio-oss為對(duì)照,通過大體觀察、he染色、masson染色、免疫組化染色,考察其異位成骨能力。結(jié)果:1、與go膜相比,rgd-go生物膜線粗糙度和面粗糙度增加,親水性提高,ft-ir檢測(cè)發(fā)現(xiàn),rgd-go生物膜1732cm-1的羧基(c-oh)吸收峰減弱,增加了1533cm-1和1290cm-1兩處吸收峰,而該兩個(gè)波數(shù)吸收峰分別對(duì)應(yīng)rgd肽的酰胺i和酰胺ii的特征峰;電化學(xué)性質(zhì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn):rgd肽共價(jià)修飾在go表面后,rct值從2.1e4Ω增加至4.7e4Ω,cpe-t值進(jìn)一步增加至5.3e-6c。2、hpdlfs在兩種膜表面的細(xì)胞活力都隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,但在rgd-go生物膜上呈現(xiàn)更高的增殖能力(p0.05)。激光共聚焦顯微鏡下顯示:rgd-go生物膜表面細(xì)胞密度值顯著高于go膜表面細(xì)胞密度值,rgd-go生物膜表面細(xì)胞鋪展面積顯著高于go膜表面的細(xì)胞平均面積(p0.05)。顯微鏡下顯示hpdlfs能夠培養(yǎng)在rgd-go生物膜修飾的ito電極表面;其粘附增殖的電化學(xué)阻抗分析測(cè)量顯示:隨著hpdlfs在rgd-go生物膜修飾的ito電極表面的粘附和增殖,ccell在2h~24h迅速降低,細(xì)胞鋪展形成細(xì)胞單層時(shí),ccell穩(wěn)定在8.2~8.5nf(72h),略高于hpdlfs在go修飾的ito電極表面的7.6~8.1nf;hpdlfs在rgd-go生物膜修飾的ito電極表面增殖中的rcell值持續(xù)增大,形成細(xì)胞單層(72h)時(shí)rcell值達(dá)到最大,約為1382Ω,在hpdlfs增殖過程中(24h及48h),細(xì)胞在rgd-go生物膜修飾ito電極表面的rcell值高于細(xì)胞在go修飾ito電極表面的rcell值;hpdlfs細(xì)胞在rgd-go生物膜修飾ito電極表面增殖過程中r′s持續(xù)增大,在接種72h后達(dá)到最大值(~338Ω),且增殖過程中r′s值均高于hpdlfs細(xì)胞在go修飾ito電極表面增殖過程中的r′s值。這些結(jié)果與細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果相吻合。以rgd-go生物膜為電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)界面的細(xì)胞生物傳感器來研究lps對(duì)hpdlfs細(xì)胞增殖的影響,電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)結(jié)果與cck-8測(cè)定的結(jié)果相似。3、c3h10t1/2細(xì)胞接種在rgd-go生物膜表面后,顯微鏡和激光共聚焦均顯示:rgd-go生物膜能夠支持細(xì)胞粘附伸展并促進(jìn)細(xì)胞粘附增殖。與go相比,rgd-go生物膜表面細(xì)胞分別在培養(yǎng)3天、5天、7天、9天時(shí)堿性磷酸酶活性持續(xù)增高(p0.05),培養(yǎng)9天后堿性磷酸酶染色呈現(xiàn)陽(yáng)性,培養(yǎng)14天后茜素紅染色陽(yáng)性;在培養(yǎng)9天后成骨相關(guān)基因opn、ocn、runx2的表達(dá)水平顯著高于go組和對(duì)照組(p0.05)。4、rgd-go生物膜植入sd大鼠皮下2周、4周、8周、12周后,與bio-oss骨支架材料一樣均未見炎癥細(xì)胞和異物巨噬細(xì)胞,而且植入材料與組織界限逐漸清晰,由最初的薄層纖維樣物到形成纖維膜樣物、周圍纖維組織逐漸增厚,植入皮下材料范圍逐漸減小。5、裸鼠皮下植入8周后he染色、masson染色結(jié)果顯示復(fù)合了干細(xì)胞的bio-oss/rgd-go均為陽(yáng)性,免疫組化分析可見成骨的基質(zhì)或骨樣組織。結(jié)論:1、本實(shí)驗(yàn)成功的合成了rgd-go生物膜,所獲得的rgd-go生物膜具有好的穩(wěn)定性和特殊的電化學(xué)特征,能夠作為新型的細(xì)胞傳感器界面實(shí)現(xiàn)細(xì)胞體外電化學(xué)檢測(cè)分析。2、rgd-go生物膜具有良好的體外生物相容性,具有增強(qiáng)細(xì)胞粘附增殖、誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的能力,在未加成骨誘導(dǎo)液的前提下可以實(shí)現(xiàn)C3H10T1/2干細(xì)胞的成骨分化。3、RGD-GO生物膜具有良好的體內(nèi)生物相容性;體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)表明復(fù)合了C3H10T1/2干細(xì)胞的RGD-GO生物膜可以成骨。本實(shí)驗(yàn)通過一種直接、簡(jiǎn)單的方法實(shí)現(xiàn)了GO表面生物功能化,通過一系列表征、EIS檢測(cè)分析,為RGD共價(jià)結(jié)合氧化石墨烯生物膜作為細(xì)胞生物傳感器的傳感界面提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ);通過體內(nèi)外生物相容性、體外成骨分化、體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn),為后期研究電刺激下促進(jìn)成骨分化加強(qiáng)、牙周再生的可能性、作為生物膜覆蓋在仿生骨支架材料表面加強(qiáng)成骨分化提供了一定的應(yīng)用參考依據(jù)。
[Abstract]:A new kind of RGD - GO biofilm has been used in bone tissue engineering . The growth of hpdlfs on the surface of rgd - go biofilm was investigated by means of electrochemical impedance spectroscopy ( eis ) . The results showed that rgd - go biofilm can support cell adhesion stretching and promote cell adhesion and proliferation . The bone formation differentiation of C3H10T1 / 2 stem cells can be realized without addition of bone inducing fluid . The RGD - GO biofilm has good biocompatibility in vivo . The experiments of ectopic osteogenesis in vivo show that the RGD - GO biofilm of C3H10T1 / 2 stem cells can be formed into bone . Through a series of characterization and EIS detection analysis , this experiment provides an experimental basis for RGD covalent binding of graphene oxide film as the sensing interface of cell biosensor .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R318.08

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本文編號(hào)：2057475