本文選題：組織化工程室 + PLGA　； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：第一部分利用一種新型的組織工程室在體構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)一兔自體耳廓軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定的實(shí)驗(yàn)研究 目的:探討兔耳廓軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)的方法及其傳代過程中細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞外基質(zhì)的變化。方法：取兔耳廓軟骨采用胰蛋白酶結(jié)合Ⅱ型膠原酶消化的方法進(jìn)行分離、培養(yǎng)及鑒定。結(jié)果：原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞呈多角形，第4代開始細(xì)胞表型發(fā)生改變。細(xì)胞培養(yǎng)3代以內(nèi)，仍能保持表型及生物學(xué)特性的穩(wěn)定。結(jié)論：采用二種或多種酶聯(lián)合消化的方法可縮短消化時(shí)間，提高細(xì)胞純度及培養(yǎng)效率；本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的第2代新西蘭大白兔耳廓軟骨細(xì)胞，具備很強(qiáng)的增殖及分泌合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力，，能提供實(shí)驗(yàn)所需的足量軟骨細(xì)胞。適用于軟骨組織工程的研究。 實(shí)驗(yàn)二體外構(gòu)建軟骨細(xì)胞-支架復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)研究 觀察比較膠原凝膠及PLGA膠原凝膠復(fù)合支架在體外對(duì)兔耳廓軟骨細(xì)胞黏附、分化及增殖的效果。方法：構(gòu)建軟骨細(xì)胞/膠原凝膠和軟骨細(xì)胞/PLGA膠原凝膠復(fù)合物，并進(jìn)行體外培養(yǎng)觀察。通過大體形態(tài)、組織學(xué)、掃描電鏡觀察兩者在體外培養(yǎng)過程中形成軟骨的能力。結(jié)果:術(shù)后14天，接種在不同支架上的軟骨細(xì)胞復(fù)合物均形成了白色新生軟骨樣組織；掃描電鏡可見軟骨細(xì)胞呈圓形，在支架材料內(nèi)均勻分布，黏附及生長(zhǎng)良好，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)；HE切片見復(fù)合物中軟骨細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞外基質(zhì)融合成片；甲苯胺藍(lán)及番紅“O”細(xì)胞外基質(zhì)特異性染色呈陽性。結(jié)論：體外培養(yǎng)環(huán)境下，軟骨細(xì)胞在膠原凝膠及PLGA凝膠支架材料上都能維持正常生長(zhǎng)及合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力，但是其在體內(nèi)及長(zhǎng)期效果還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。 實(shí)驗(yàn)三利用在體組織工程室構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究 目的：初步探索我科自主研制的新型多孔硅膠組織工程室內(nèi)滲液微環(huán)境是否能支撐軟骨細(xì)胞-支架復(fù)合物的存活及生長(zhǎng)，構(gòu)建組織工程軟骨的可行性。方法：將構(gòu)建好的軟骨細(xì)胞-支架復(fù)合物置入組織工程室內(nèi)，再植入實(shí)驗(yàn)兔背部皮下，無需和血管溝通；對(duì)照組無組織工程室，直接將復(fù)合物植入同一實(shí)驗(yàn)兔背部皮下。術(shù)后8周進(jìn)行大體形體觀察、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色、RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果：通過大體形體、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，顯示在實(shí)驗(yàn)兔背部皮下組織工程室內(nèi)，構(gòu)建的軟骨細(xì)胞-支架復(fù)合物均形成了軟骨樣組織；而直接植入實(shí)驗(yàn)兔背部皮下的復(fù)合物最終消失或者形成一纖維化的結(jié)節(jié)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)打破了目前大多數(shù)在體組織工程室需要血管化的思路，在具有免疫活性的動(dòng)物體內(nèi)無需和血管溝通，應(yīng)用自主研制的新型多孔硅膠組織工程室內(nèi)微環(huán)境成功構(gòu)建了自體組織工程軟骨，為軟骨組織工程技術(shù)過渡到臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。 第二部分構(gòu)建無外支架組織工程軟骨修復(fù)肋軟骨供區(qū)缺損的實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)一兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs）分離、培養(yǎng)及其鑒定的方法。方法：應(yīng)用密度梯度離心和貼壁篩選法分離、培養(yǎng)兔BMSCs，觀察兔BMSCs的生長(zhǎng)特點(diǎn)、形態(tài)學(xué)特征，體外經(jīng)成軟骨、成脂肪和成骨誘導(dǎo)液分別誘導(dǎo)BMSCs向軟骨、脂肪和骨細(xì)胞分化。并進(jìn)行甲苯胺藍(lán)、油紅“O”及茜素紅染色。結(jié)果：采用密度梯度離心和貼壁篩選相結(jié)合的方法，可以簡(jiǎn)單有效地獲取大量高純度，增殖能力強(qiáng)的BMSCs，可以向軟骨、骨、脂肪等細(xì)胞成功分化。結(jié)論：采用密度梯度離心和貼壁篩選相結(jié)合的方法是培養(yǎng)兔BMSCs簡(jiǎn)便有效的方法，可以滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。 實(shí)驗(yàn)二BMSCs膜片的構(gòu)建及其成軟骨誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討應(yīng)用連續(xù)培養(yǎng)及簡(jiǎn)單的機(jī)械方法，培養(yǎng)獲取BMSCs膜片，并在體外向軟骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)。方法：將兔BMSCs在成軟骨誘導(dǎo)條件下，連續(xù)培養(yǎng)14天，用細(xì)胞刮刀沿培養(yǎng)皿底壁外周向中心仔細(xì)刮擦，獲得完整的細(xì)胞膜片。經(jīng)組織學(xué)、電鏡等方法檢測(cè)細(xì)胞膜片的理化特性。結(jié)果：應(yīng)用連續(xù)培養(yǎng)及細(xì)胞刮刀可獲得完整的BMSCs膜片。在成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，BMSCs仍快速增殖，形成的細(xì)胞膜片經(jīng)HE染色顯示其由6-8層細(xì)胞組成，甲苯胺藍(lán)、番紅“O”染色呈陽性；電鏡下可見細(xì)胞分布均勻、緊密排列，分泌細(xì)胞外基質(zhì)。結(jié)論：通過連續(xù)培養(yǎng)及簡(jiǎn)單的機(jī)械方法可以有效獲取BMSCs膜片，BMSCs膜片具有體外成軟骨分化的潛能，有望用來構(gòu)建組織工程軟骨。 實(shí)驗(yàn)三成軟骨誘導(dǎo)BMSCs膜片修復(fù)肋軟骨供區(qū)缺損的實(shí)驗(yàn)研究 目的：采用兔胸廓損傷動(dòng)物模型，觀察成軟骨誘導(dǎo)的BMSCs膜片對(duì)肋軟骨供區(qū)再生修復(fù)的影響。方法：16只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分成4組（每組4只）。切取各實(shí)驗(yàn)組兔雙側(cè)4-6肋一段肋軟骨，缺損部位采取3種不同方法處理，①不縫合軟骨膜；②BMSCs膜片折疊數(shù)層成圓筒狀填塞入肋軟骨缺損處縫合；③成軟骨誘導(dǎo)的BMSCs膜片同法折疊數(shù)層成圓筒狀填塞入肋軟骨缺損處，縫合封閉缺損，3種方法在各實(shí)驗(yàn)組兔兩側(cè)肋軟骨中兩兩配對(duì)，健康對(duì)照組不做處理。術(shù)后16周后處死動(dòng)物取材進(jìn)行大體觀察，常規(guī)HE染色，測(cè)量各實(shí)驗(yàn)組兔肋軟骨的平均寬度，并行生物力學(xué)檢測(cè)測(cè)定所有肋軟骨的抗壓強(qiáng)度及彎曲強(qiáng)度。結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組家兔的胸廓整體形態(tài)均較良好，各組及各處理方法之間并無明顯差別。方法1處理的修復(fù)組織平均寬度顯著大于健康對(duì)照組肋軟骨的平均寬度(P 0.01)，方法2、3處理的修復(fù)組織平均寬度與健康對(duì)照組肋軟骨平均寬度相比無顯著性差異(P0.05)；生物力學(xué)檢測(cè)顯示：3種處理方法之間均存在差異(P0.01)，方法3處理的修復(fù)組織的抗壓、彎曲強(qiáng)度與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），方法1，2處理的修復(fù)組織的抗壓、彎曲強(qiáng)度明顯低于健康對(duì)照組(P0.01)，方法2處理的修復(fù)組織的抗壓、彎曲強(qiáng)度優(yōu)于方法1；組織切片HE染色病理觀察，可見方法1、2處理的修復(fù)組織主要為纖維組織，方法3處理的修復(fù)組織內(nèi)，可見新生的軟骨細(xì)胞和大量的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)。結(jié)論：成軟骨誘導(dǎo)的BMSCs膜片可以促進(jìn)肋軟骨供區(qū)軟骨細(xì)胞的再生，修復(fù)肋軟骨供區(qū)缺損，維持胸廓的正常形態(tài)和穩(wěn)定性，從而降低術(shù)后胸廓畸形的發(fā)生率。
[Abstract]:The first part uses a new tissue engineering chamber to construct the tissue engineering cartilage in vivo .

Isolation , culture and identification of rabbit autologous auricle chondrocytes

Objective : To investigate the isolation , culture and changes of cell morphology and extracellular matrix in rabbit auricle cartilage cells . Methods : The rabbit auricle cartilage was isolated , cultured and identified by trypsin - binding type 鈪

本文編號(hào)：1914514