發(fā)布時間：2018-04-29 07:55

  本文選題：組織工程 + 種子細胞　； 參考：《南方醫(yī)科大學》2013年博士論文

【摘要】：研究背景 因創(chuàng)傷、疾病、遺傳缺陷以及一些手術操作所導致的尿道缺損是泌尿外科的常見疾病,尿道組織缺損經常導致尿道內瘢痕形成、尿道狹窄、排尿障礙,有時更會合并下尿路反復感染。病人往往非常痛苦,這時只有尿道組織重建才能是解決病人痛苦的唯一出路。對于尿道組織的重建,人們研究了多種方法,包括單純材料移植,自體組織移植,如自體口腔黏膜移植,以及復合細胞的組織工程尿道組織移植,組織工程尿道在尿道組織缺損治療這一領域已經顯現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。 組織工程作為近年來快速興起的一項全新技術,為修復尿道組織缺損提供了嶄新的思路與方法。為了能更清楚地了解組織工程技術,先讓我們回顧一下組織工程的發(fā)展歷史；1994年,美國學者Vacanti等首先利用組織工程學技術,成功制備出具有一定形態(tài)結構的小�；钚匀斯す恰ｋS后,國內外學者對組織工程進行了全面的發(fā)展,包括種子細胞的獲取、支架材料的研制、生長因子的作用、細胞—支架材料立體培養(yǎng)等。組織工程技術的優(yōu)點包括：所構建供應移植物具細胞生物活性、生物材料來源廣泛、可根據(jù)所需預制成形、若采用自體細胞則可大副降低免疫原性、同時避免了自體組織缺損的并發(fā)癥等。在組織工程化尿道的研究方面,科研工作者們對尿道缺損的組織工程修復技術進行了較為深入的研究,取得了初步成果,證實尿道組織工程學技術修復尿道缺損的可行性。組織工程學的迅猛發(fā)展預示著現(xiàn)代醫(yī)學將由器官移植時代轉變?yōu)槠鞴僦亟ǖ臅r代。 盡管組織工程尿道的發(fā)展前景非常另人鼓舞,但組織工程尿道的研究中仍然遇到很多問題,理想的種子細胞問題作為組織工程關鍵性問題之一,制約著尿道組織工程的發(fā)展；現(xiàn)階段在尿道組織工程研究中,表皮細胞、口腔黏膜上皮細胞都曾先后被作為尿道組織工程上皮的種子細胞,但這些種子細胞與理想的尿道組織工程種子細胞仍相距甚遠；無論表皮細胞還是口腔黏膜上皮細胞,都要造成病人自身組織的缺損,同時,表皮細胞與口腔黏膜上皮細胞都屬于成體細胞,體外被培養(yǎng)擴增等能力都十分有限。而近些年來作為研究熱門的胚胎干細胞或iPS細胞,雖然具有極強的體外擴增與分化能力,但都因為其可能出現(xiàn)的致瘤性而不適合組織構建。本研究試圖探索毛囊干細胞作為種子細胞的可行性,首先因為在基礎與臨床研究等多個方面,有多位學者報道毛囊干細胞可以特定地向表皮細胞分化總而替代損傷的表皮；其次,毛囊干細胞作為成體干細胞保留了干細胞應有的極強的體外擴增能力,同時又避免了應用胚胎干細胞可能出現(xiàn)的致瘤性。更重要的是,毛囊干細胞在獲取過程中能最大限度的避免對供體的組織傷害。 本研究的核心內容之一就是分選富集毛囊干細胞,研究毛囊干細胞的分選富集方法以及毛囊細胞的擴增規(guī)律,來為組織工程尿道的構建提供指導,就成了本研究的必須首要解決的問題,因此,毛囊干細胞的分選富集就成為本研究各個實驗組成部分的基礎,也構成了本論文的第一部分的研究內容。同時,毛囊細胞體外擴增規(guī)律的研究一直就與干細胞的研究密不可分。我們擬探索毛囊干細胞的分選富集方法,記錄毛囊干細胞的體外擴增的規(guī)律。我們選擇兔胡須來源的毛囊干細胞進行體外擴增規(guī)律的研究,通過生長動力學方法及細胞培養(yǎng)計數(shù)來研究其擴增的潛力；以克隆形成率、Keratin19、Keratin15,CD200的表達情況來驗證評價分選后所得到的毛囊干細胞含量與純度,評估分選方法；分析毛囊干細胞在體外擴增過程中的含量變化；初步探討毛囊干細胞的體外擴增機制。 根據(jù)已有的研究報道,復合上皮的的組織工程尿道支架優(yōu)于單純材料支架,上皮細胞的作用不可忽視。表皮細胞、口腔黏膜上皮細胞,都曾被報道用于構建組織工程尿道的粘膜上皮層；脂肪干細胞、骨髓干細胞也被報道用于構建組織工程尿道的粘膜下層組織。組織工程尿道復合物構建時所使用的各種不同的細胞都有著各自不同的優(yōu)勢,但是,假如使用表皮細胞、口腔黏膜細胞,作為種子細胞,細胞的來源和細胞的數(shù)量都相對有限。因此,如果要保證組織工程尿道粘膜層的構建取得更加理想的效果,新的種子細胞來源是人們繼續(xù)探索的重要內容之一。毛囊干細胞的來源相對豐富,毛囊干細胞的收集獲取過程也相對比較容易,更重要的是毛囊干細胞與表皮干細胞的生物學特性十分相似,所以,毛囊干細胞是構建組織工程尿道的良好候選細胞；換言之,毛囊干細胞很有可能成為尿道組織工程種子細胞的新來源；雖然毛囊干細胞與表皮干細胞的生物學特性十分相似,但是,人們對毛囊干細胞與尿道粘膜干細胞的生物學表型差異還并不十分清楚,因此,探索與比較毛囊干細胞與尿道粘膜干細胞的生物學表型差異是正待解決的重要問題之一。而且,我們在上一部分研究中,已經建立了毛囊干細胞分選富集的方法,獲得了質量相對穩(wěn)定的毛囊干細胞,為本部分研究的開展奠定了基礎。更重要的是,目前關于毛囊干細胞與尿道粘膜干細胞的生物學表型的比較研究也鮮有報道,我們需要進一步比較毛囊干細胞與尿道粘膜干細胞的生物學表型。 種子細胞與支架材料是組織工程不可缺少的必要因素,組織工程支架材料分類方法有多種。根據(jù)材料來源可分為：天然支架材料與人工合成支架材料。組織工程天然材料的代表有：脫細胞真皮,煅燒珊瑚,脫細胞膀胱,脫細胞小腸粘膜下組織等等。人工合成支架材料代表有聚羥基乙酸,又名聚乙醇酸(Polyglycolic acids,PGA),聚乳酸(Polylactic acid, PLA),及聚羥基乙酸共聚物[Poly(D,L-lactic-co-glycolic)acid]PLAG,磷酸三鈣(tricalcium phosphate,TCP)等等。組織工程支架材料是根據(jù)材料用途,即應用于不同類型的人體組織,并根據(jù)其所具體將要替代的組織所要具備的功能而設計的。組織工程支架材料包括：皮膚、軟骨、神經、血管、骨和人工器官,如肝、脾、腎、膀胱等。肝、胰、腎、泌尿系統(tǒng)使用的組織工程支架材料多為可降解材料,目前這方面研究和使用的材料,以天然蛋白質、多糖人工合成的高分子聚合物為主的可降解材料,例如：用于構建組織工程肝臟的支架的血漿纖維蛋白和聚乳酸,用于尿道組織工程的聚乙醇酸等。BAMG作為膀胱脫細胞基質與泌尿系統(tǒng)組織近似度極高,適用于尿道組織工程的構建。而BAMG作為天然脫細胞材料,其生物學性質也必須進行明確的研究。 當種子細胞與生物材料的研究能夠為組織工程尿道構建提供理論依據(jù),以及參數(shù)指導后,我們就可以開展應用毛囊干細胞與BAMG構建組織工程尿道修復兔尿道缺損動物模型的實驗研究。當然,我們研究的最終目的是將研究結果服務于臨床。換句話說,關于毛囊干細胞以及膀胱脫細胞基質的研究基礎,都應滿足構建組織工程尿道的需要。 綜上所述,我們會在本研究中,探索利用毛囊來源的干細胞構建組織工程尿道的可行性,并將人工構建的組織工程尿道,用于兔尿道缺損的動物模型。為推動尿道組織工程的發(fā)展和應用提供參數(shù)和理論依據(jù)。希望最終能將該項目的研究成果早日應用于臨床病人,服務人類、造福人類。 目的 我們進行此項研究的目的是探索體外分離、富集培養(yǎng)毛囊干細胞的優(yōu)化條件,比較毛囊干細胞與尿道粘膜上皮來源干細胞的生物學特性差別,進一步研究毛囊干細胞的分化和構建組織工程尿道粘膜層的可行性,并最終應用于修復兔尿道缺損。為臨床治療尿道缺損,修復尿道提供理論依據(jù)及指導。 方法 本實驗研究的毛囊干細胞來源于新西蘭大白兔,以戊巴比妥靜脈注射將兔麻醉后,在無菌條件下取兔雙側觸須部全層皮膚。鈍性分離單個毛囊組織。采用“兩步酶”法從單個毛囊組織中獲取單個細胞,并用于各種檢測,或者將消化后的單細胞,以2×108/L密度接種到培養(yǎng)瓶中,置于5%CO2.37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3d換液,待細胞達到90%融合時按1：3傳代。使用流式細胞儀分別分選直徑10um且為CD200(+)/CD34(-)表型的毛囊干細胞與尿道黏膜上皮干細胞,分離培養(yǎng)兔毛囊干細胞與尿道黏膜上皮干細胞,體外原代培養(yǎng)擴增,記錄并描繪兔毛囊干細胞與尿道黏膜干細胞的生長曲線,比較兩種細胞的最大擴增倍數(shù)、克隆形成能力；使用流式細胞儀檢測分選后兩種細胞K19,p63,β1-integrin的陽性表達率。 注射過量麻醉劑(戊巴比妥100mg/kg)處死實驗動物兔,完整切取兔膀胱組織,將膀胱外翻,刮除黏膜層,在50m l磷酸鹽緩沖液(PBS, pH值7.0,10mmol/L)和0.1%疊氮鈉的混合液中攪拌5-6h,使細胞溶解,以去除基底膜和逼尿肌。用PBS漂洗,在50ml1mol/L NaC1溶液(含脫氧核糖核酸酶2000kU)中攪拌6-8h,使細胞徹底溶解,細胞組分完全釋放。在50m l含4%脫氧膽酸鈉和0.1%疊氦鈉的混合液中攪拌5-6h,使細胞膜脂質雙層和細胞內的膜脂質溶解。重復第3步驟制成BAMG。BAMG用PBS沖洗3次后貯存在10%新霉素溶液中。 將分選富集的毛囊干細胞接種在組織工程支架材料上,構建組織工程尿道。體外嘗試尿道黏膜上皮干細胞構建組織工程尿道。應用組織學、熒光染色法觀察比較毛囊干細胞與尿道黏膜上皮干細胞體外構建的組織工程尿道的情況。利用掃描電鏡觀察各種不同類別組織工程尿道的細胞在支架上分布狀態(tài),將毛囊干細胞構建的組織工程尿道修復2.5cmm兔尿道缺損,組織學、尿道造影觀察缺損修復情況。結果 流式細胞儀顯示：在所分析的樣品中,存在明顯的兩群顆粒,一群為前向散射光參數(shù)分布較廣泛的顆粒群,我們將其判斷為細胞樣品,另一群顆粒為小矩形區(qū)域內,前向散射光參數(shù)分布較集中的顆粒群,該群顆粒直徑大小相對均一,而且同時表達三種熒光。 毛囊干細胞經過流式細胞儀分選后,被移入直徑10cm的培養(yǎng)皿中,然后置于倒置相差顯微鏡下觀察。在同一放大倍數(shù)下,未分選的細胞群體,可見細胞直徑大小不一。根據(jù)小細胞直徑分選的細胞的群體,體積較小而且相對均一；根據(jù)大細胞直徑分選的細胞的群體,體積較大而且相對均一。兔毛囊干細胞與尿道黏膜干細胞的最大擴增倍數(shù)分別為(6.1±0.8)×104倍和(7.1±1.1)×103倍。 通過細胞標記、細胞大小、復合參數(shù)分選以及未分選的細胞群體克隆形成面積分別為：205.37±33.18(mm2),197.72±25.31(mm2),359.79±59.57(mm2),3.10±1.07(mm2)。復合參數(shù)分選的細胞群體克隆形成面積最大,并且與其余三組數(shù)據(jù)存在統(tǒng)計學差異(P0.05)。 通過細胞標記(Marker sort)、細胞大小(Small size)、復合參數(shù)分選(Marker+small size)方式以及未分選(Unsort)而獲得的細胞群體經過克隆染色后可見：復合參數(shù)分選所獲得的細胞克隆數(shù)量及面積明顯大于其它三組。未分選的細胞克隆數(shù)量不明顯。 毛囊干細胞與尿道黏膜干細胞體外構建1個月的組織工程尿道HE染色。毛囊干細胞與尿道黏膜干細胞在支架上都能形成復層上皮樣結構,兩類細胞所構建的組織在組織學上結構相似。粘膜下未見明顯瘢痕組織增生富集毛囊干細胞表達K19,p63,β1-integrin,尿道支架具有良好的生物相容性,毛囊細胞在支架上形成復層上皮樣結構AE1/AE3染色陽性。掃描電鏡可見細胞與支架緊密貼附,適度伸展并有基質分泌,毛囊干細胞構建的組織工程尿道修復兔尿道缺損效果良好,而對照組為纖維瘢痕組織修復。毛囊干細胞與尿道黏膜干細胞體外構建1個月的組織工程尿道免疫熒光AE1/AE3染色,可見在構建的上皮組織內明顯有綠色熒光表達。 組織工程支架材料的組織學染色結果顯示脫細胞基質材料內未見細胞結構,材料中膠原纖維呈現(xiàn)天然的分布狀態(tài),纖維之間有可供細胞容納的孔隙結構。單純膀胱脫細胞材料的抗拉強度較高彈性模量與正常組織接近,能夠滿足組織構建對材料的需要。體外脫細胞基質材料細胞與毛囊干細胞共培養(yǎng)的結果顯示,細胞與材料相容性良好,能充分粘附與材料表面,并正常分泌細胞基質；貼附于材料上的細胞能夠自由遷移。 植入動物體內的脫細胞材料未引起動物組織明顯的免疫排斥反應,說明材料在處理過程中各種致炎物質已被徹底的處理。同時,也在體內進一步驗證了膀胱脫細胞基質材料與體內細胞存在良好的細胞組織相容性�？梢�,細胞在支架上能形成復層上皮樣結構,毛囊干細胞所構建的組織在組織學與正常尿道組織結構相似。粘膜下未見明顯瘢痕組織增生。結論 通過流式細胞儀對細胞表面標記以及細胞直徑雙重參數(shù)的優(yōu)化,毛囊干細胞可以被分選富集。兔毛囊干細胞與尿道黏膜干細胞具有相似表型,可以作為尿道組織工程種子細胞被用于構建組織工程尿道,在種子細胞獲取方面,毛囊干細胞更優(yōu)于尿道黏膜干細胞。富集的兔毛囊干細胞構建組織工程尿道修復效果優(yōu)于未富集毛囊干細胞構建組織工程尿道的修復效果。應用富集的兔毛囊干細胞構建組織工程尿道可用于兔尿道缺損的修復治療,修復效果良好,有進一步用于臨床研究的可能。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R699.6;R318.08

【參考文獻】

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本文編號：1819074