本文選題：微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) + 生物微加工　； 參考：《華南理工大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：在體內(nèi),細(xì)胞所處的微環(huán)境對其增殖、分化等有著重要的調(diào)控作用。隨著分子生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,人們意識到材料表面性質(zhì)如親疏水性、化學(xué)組成、表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等對細(xì)胞有很重要的影響。微納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)作為體內(nèi)體外對細(xì)胞行為影響的重要因素,研究其對細(xì)胞行為的影響規(guī)律,揭示其內(nèi)在機理,對胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、組織工程及再生醫(yī)學(xué)等學(xué)科的發(fā)展均有重要意義。得益于微加工技術(shù)的發(fā)展,近幾年人們研究了各種微納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞的影響,并取得了諸多成果,加深了人們對細(xì)胞與其生長微環(huán)境相互作用的理解,也為體外組織構(gòu)建和醫(yī)學(xué)植入體材料的表面處理提供了理論依據(jù)。納米級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能與細(xì)胞表面分子直接作用,從而影響細(xì)胞的命運;亞微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能與細(xì)胞器相互作用,影響細(xì)胞的形態(tài),從而影響細(xì)胞的命運;微米級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能影響細(xì)胞群的組織、遷移,從而影響組織形態(tài)的發(fā)生、損傷的修復(fù)。目前大量研究主要集中在納米及亞微米結(jié)構(gòu)對細(xì)胞行為的影響,而微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞的影響則較少被關(guān)注。微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)作為組織中不同于納米和亞微米的第三級結(jié)構(gòu),對骨和軟骨修復(fù)最終宏觀結(jié)構(gòu)的形成和功能的實現(xiàn)極為重要。密質(zhì)骨和關(guān)節(jié)軟骨均為多級有序結(jié)構(gòu),這種多級有序結(jié)構(gòu)為實現(xiàn)其功能有著舉足輕重的作用。但是,目前關(guān)于骨和軟骨修復(fù)的研究,主要表征和關(guān)注骨和軟骨相關(guān)基因的表達及蛋白的分泌,但是對它們的組織形式和結(jié)構(gòu)予以很少研究和關(guān)注。本研究希望通過研究各種尺寸和形狀的微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞群分布、遷移、分化及聚集的影響,從而構(gòu)建一種具有多種形狀的微米組合拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的表面。一方面,該拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表面能引導(dǎo)細(xì)胞定向遷移募集,從而實現(xiàn)促骨缺損愈合,及骨和軟骨一體化修復(fù)。另一方面,該拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表面所具有的多種形狀的微米級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能于不同位置促進細(xì)胞向成骨或成軟骨分化,引導(dǎo)細(xì)胞在微米尺寸的排列,從而使其所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)與天然骨或軟骨相似,以更好地實現(xiàn)組織修復(fù)、功能重建。在眾多的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)制備方法中,我們選用軟光刻在生物材料表面制備微米級的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。為了獲得較深的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),我們選用Fururrex公司的負(fù)性厚光刻膠。厚光刻膠由于其高達幾百微米的厚度,其光刻工藝和薄光刻膠的光刻工藝有較大差異。且各實驗室條件不同,光刻工藝也略有差異。我們根據(jù)該光刻膠的特性,結(jié)合本實驗具體情況,對光刻工藝參數(shù)進行優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合軟光刻的幾種成型工藝,我們成功地在聚己內(nèi)酯(pcl)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、殼聚糖(cs)、生物玻璃(bg)表面制備了各種形狀、不同尺寸的微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),并成功構(gòu)建了bg/pcl復(fù)合圖案化表面。間充質(zhì)干細(xì)胞(hmscs)在骨和軟骨修復(fù)研究中廣為關(guān)注。在我們的研究中,hmscs在微米溝槽表面表現(xiàn)出除了“接觸誘導(dǎo)”外更為復(fù)雜的行為。我們首次觀察到了hmscs懸空橫跨在寬達100μm的溝槽上的現(xiàn)象。hmscs的這種“架橋”行為對組織修復(fù)是有利還是有弊?為此我們對該現(xiàn)象做了系統(tǒng)深入的研究。實驗結(jié)果表明,hmscs在溝槽底部,通過攀住溝槽的側(cè)壁而實現(xiàn)這種“架橋”行為。hmscs只在寬深比2的溝槽上形成“架橋”。微絲及細(xì)胞核染色表明,架橋的hmscs微絲發(fā)生解聚并在邊緣形成“肌動蛋白邊緣束”,細(xì)胞核也發(fā)生明顯的畸變。afm對細(xì)胞彈性模量的測試表明,架橋細(xì)胞的彈性模量和對照組比沒有差異。骨鈣蛋白染色、alp及茜素紅染色表明,架橋的hmscs并沒有向成骨分化。結(jié)蛋白的染色結(jié)果表明,部分架橋的hmscs提高了結(jié)蛋白的表達,特別是被拉伸得又長又細(xì)的細(xì)胞。此外,這種“架橋”行為并非hmscs特有,atdc5(小鼠畸胎瘤細(xì)胞)、mg-63(人骨肉瘤細(xì)胞)和c2c12(小鼠成肌細(xì)胞)均能在溝槽上實現(xiàn)“架橋”行為,但它們彼此之間也略有差異。為了研究拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)促骨愈合及引導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨損傷部位募集的能力,我們采用體外劃痕實驗來研究溝槽拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞定向生長的影響。微米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能極大地促進mg-63細(xì)胞平行于溝槽方向生長,卻抑制mg-63細(xì)胞垂直于溝槽方向生長。進一步的研究表明,溝槽寬度對mg-63細(xì)胞平行于溝槽方向生長的速度沒有影響,但溝槽深度對mg-63細(xì)胞平行于溝槽方向的生長速度有很大影響:溝槽越淺,越有利于細(xì)胞平行于溝槽方向生長。溝槽促進或抑制細(xì)胞平行或垂直于溝槽方向生長是通過促進或抑制細(xì)胞群體平行或垂直溝槽方向來的遷移實現(xiàn)的。在溝槽邊緣的細(xì)胞首先發(fā)生極化,出現(xiàn)“接觸誘導(dǎo)”現(xiàn)象,隨著細(xì)胞的增殖,這種極化性質(zhì)通過細(xì)胞間的相互接觸被傳遞到整個細(xì)胞群,使細(xì)胞群發(fā)生群體極化并向著平行于溝槽方向遷移。此外,溝槽結(jié)構(gòu)還能促進hmscs、c2c12細(xì)胞平行于溝槽方向生長,但不能促進atdc5細(xì)胞平行于溝槽方向生長。最后,我們研究了微米級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞成骨和成軟骨分化的影響。hmscs在d25w200的pcl溝槽結(jié)構(gòu)表面的成骨分化表明:微米級溝槽結(jié)構(gòu)相比于對照組,雖不能促進hmscs的成骨分化,但能調(diào)節(jié)細(xì)胞群體的組織排列,從而調(diào)節(jié)了Ⅰ型膠原和鈣鹽沉積的組織方式,使它們呈現(xiàn)出與天然骨基質(zhì)類似的取向性結(jié)構(gòu)。bg/pcl復(fù)合圖案化表面能影響hMSCs的鋪展、形態(tài)和分布,但并沒有促進其向成骨分化。PMMA表面微米級凹坑結(jié)構(gòu)能促進ATDC5在凹坑內(nèi)的聚集,且能促進其Ⅰ型膠原和糖胺聚糖基因的表達,及軟骨特征基質(zhì)的分泌。綜上,適當(dāng)尺寸的溝槽結(jié)構(gòu)和凹坑結(jié)構(gòu)的結(jié)合,能促進骨愈合、引導(dǎo)干細(xì)胞到軟骨缺損部位募集,且能引導(dǎo)細(xì)胞分泌骨或軟骨特征基質(zhì),并調(diào)節(jié)它們組織成為與天然骨或軟骨組織類似的結(jié)構(gòu),在實現(xiàn)骨/軟骨一體化修復(fù)方面具有極大的潛在價值。
[Abstract]:In recent years , it is important to study the effect of micro - nano - topological structure on cell population distribution , migration , differentiation and aggregation . On the basis of the characteristics of the photoresist , we optimize the parameters of photoetching process according to the characteristics of the photoresist . On the basis of this , we have made a systematic study on this phenomenon . In order to study the effect of the structure of the groove on the growth of the cells in the direction of the groove , the effect of the structure of the groove on the growth of the cells in parallel or perpendicular to the groove was studied .

【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08;R687

【共引文獻】

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本文編號：1806286