本文選題：微米拓撲結構 + 生物微加工　； 參考：《華南理工大學》2015年博士論文

【摘要】：在體內,細胞所處的微環(huán)境對其增殖、分化等有著重要的調控作用。隨著分子生物學、再生醫(yī)學等學科的發(fā)展,人們意識到材料表面性質如親疏水性、化學組成、表面拓撲結構等對細胞有很重要的影響。微納米拓撲結構作為體內體外對細胞行為影響的重要因素,研究其對細胞行為的影響規(guī)律,揭示其內在機理,對胚胎發(fā)育、組織修復、組織工程及再生醫(yī)學等學科的發(fā)展均有重要意義。得益于微加工技術的發(fā)展,近幾年人們研究了各種微納米拓撲結構對細胞的影響,并取得了諸多成果,加深了人們對細胞與其生長微環(huán)境相互作用的理解,也為體外組織構建和醫(yī)學植入體材料的表面處理提供了理論依據。納米級拓撲結構能與細胞表面分子直接作用,從而影響細胞的命運;亞微米拓撲結構能與細胞器相互作用,影響細胞的形態(tài),從而影響細胞的命運;微米級拓撲結構能影響細胞群的組織、遷移,從而影響組織形態(tài)的發(fā)生、損傷的修復。目前大量研究主要集中在納米及亞微米結構對細胞行為的影響,而微米拓撲結構對細胞的影響則較少被關注。微米拓撲結構作為組織中不同于納米和亞微米的第三級結構,對骨和軟骨修復最終宏觀結構的形成和功能的實現極為重要。密質骨和關節(jié)軟骨均為多級有序結構,這種多級有序結構為實現其功能有著舉足輕重的作用。但是,目前關于骨和軟骨修復的研究,主要表征和關注骨和軟骨相關基因的表達及蛋白的分泌,但是對它們的組織形式和結構予以很少研究和關注。本研究希望通過研究各種尺寸和形狀的微米拓撲結構對細胞群分布、遷移、分化及聚集的影響,從而構建一種具有多種形狀的微米組合拓撲結構的表面。一方面,該拓撲結構表面能引導細胞定向遷移募集,從而實現促骨缺損愈合,及骨和軟骨一體化修復。另一方面,該拓撲結構表面所具有的多種形狀的微米級拓撲結構能于不同位置促進細胞向成骨或成軟骨分化,引導細胞在微米尺寸的排列,從而使其所分泌的細胞外基質與天然骨或軟骨相似,以更好地實現組織修復、功能重建。在眾多的拓撲結構制備方法中,我們選用軟光刻在生物材料表面制備微米級的拓撲結構。為了獲得較深的拓撲結構,我們選用Fururrex公司的負性厚光刻膠。厚光刻膠由于其高達幾百微米的厚度,其光刻工藝和薄光刻膠的光刻工藝有較大差異。且各實驗室條件不同,光刻工藝也略有差異。我們根據該光刻膠的特性,結合本實驗具體情況,對光刻工藝參數進行優(yōu)化。在此基礎上,結合軟光刻的幾種成型工藝,我們成功地在聚己內酯(pcl)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、殼聚糖(cs)、生物玻璃(bg)表面制備了各種形狀、不同尺寸的微米拓撲結構,并成功構建了bg/pcl復合圖案化表面。間充質干細胞(hmscs)在骨和軟骨修復研究中廣為關注。在我們的研究中,hmscs在微米溝槽表面表現出除了“接觸誘導”外更為復雜的行為。我們首次觀察到了hmscs懸空橫跨在寬達100μm的溝槽上的現象。hmscs的這種“架橋”行為對組織修復是有利還是有弊?為此我們對該現象做了系統深入的研究。實驗結果表明,hmscs在溝槽底部,通過攀住溝槽的側壁而實現這種“架橋”行為。hmscs只在寬深比2的溝槽上形成“架橋”。微絲及細胞核染色表明,架橋的hmscs微絲發(fā)生解聚并在邊緣形成“肌動蛋白邊緣束”,細胞核也發(fā)生明顯的畸變。afm對細胞彈性模量的測試表明,架橋細胞的彈性模量和對照組比沒有差異。骨鈣蛋白染色、alp及茜素紅染色表明,架橋的hmscs并沒有向成骨分化。結蛋白的染色結果表明,部分架橋的hmscs提高了結蛋白的表達,特別是被拉伸得又長又細的細胞。此外,這種“架橋”行為并非hmscs特有,atdc5(小鼠畸胎瘤細胞)、mg-63(人骨肉瘤細胞)和c2c12(小鼠成肌細胞)均能在溝槽上實現“架橋”行為,但它們彼此之間也略有差異。為了研究拓撲結構促骨愈合及引導干細胞向軟骨損傷部位募集的能力,我們采用體外劃痕實驗來研究溝槽拓撲結構對細胞定向生長的影響。微米拓撲結構能極大地促進mg-63細胞平行于溝槽方向生長,卻抑制mg-63細胞垂直于溝槽方向生長。進一步的研究表明,溝槽寬度對mg-63細胞平行于溝槽方向生長的速度沒有影響,但溝槽深度對mg-63細胞平行于溝槽方向的生長速度有很大影響:溝槽越淺,越有利于細胞平行于溝槽方向生長。溝槽促進或抑制細胞平行或垂直于溝槽方向生長是通過促進或抑制細胞群體平行或垂直溝槽方向來的遷移實現的。在溝槽邊緣的細胞首先發(fā)生極化,出現“接觸誘導”現象,隨著細胞的增殖,這種極化性質通過細胞間的相互接觸被傳遞到整個細胞群,使細胞群發(fā)生群體極化并向著平行于溝槽方向遷移。此外,溝槽結構還能促進hmscs、c2c12細胞平行于溝槽方向生長,但不能促進atdc5細胞平行于溝槽方向生長。最后,我們研究了微米級拓撲結構對細胞成骨和成軟骨分化的影響。hmscs在d25w200的pcl溝槽結構表面的成骨分化表明:微米級溝槽結構相比于對照組,雖不能促進hmscs的成骨分化,但能調節(jié)細胞群體的組織排列,從而調節(jié)了Ⅰ型膠原和鈣鹽沉積的組織方式,使它們呈現出與天然骨基質類似的取向性結構。bg/pcl復合圖案化表面能影響hMSCs的鋪展、形態(tài)和分布,但并沒有促進其向成骨分化。PMMA表面微米級凹坑結構能促進ATDC5在凹坑內的聚集,且能促進其Ⅰ型膠原和糖胺聚糖基因的表達,及軟骨特征基質的分泌。綜上,適當尺寸的溝槽結構和凹坑結構的結合,能促進骨愈合、引導干細胞到軟骨缺損部位募集,且能引導細胞分泌骨或軟骨特征基質,并調節(jié)它們組織成為與天然骨或軟骨組織類似的結構,在實現骨/軟骨一體化修復方面具有極大的潛在價值。
[Abstract]:In recent years , it is important to study the effect of micro - nano - topological structure on cell population distribution , migration , differentiation and aggregation . On the basis of the characteristics of the photoresist , we optimize the parameters of photoetching process according to the characteristics of the photoresist . On the basis of this , we have made a systematic study on this phenomenon . In order to study the effect of the structure of the groove on the growth of the cells in the direction of the groove , the effect of the structure of the groove on the growth of the cells in parallel or perpendicular to the groove was studied .

【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08;R687

【共引文獻】

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本文編號：1806286