本文選題：納米羥基磷灰石 + 癌癥基因治療　； 參考：《浙江理工大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：羥基磷灰石是一種由鈣離子、磷酸根離子、羥基組成的磷酸鈣復(fù)合物，分子式為Ca_(10)(OH)_2(PO_4)_6，它是構(gòu)成天然骨、牙的主要成分。羥基磷灰石具有良好的生物活性和生物相容性。其中，納米尺度的羥基磷灰石對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長有遏制作用，而對(duì)正常細(xì)胞基本無毒副作用。納米粒子通過細(xì)胞吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞；同時(shí)，羥基磷灰石顆粒在癌細(xì)胞偏酸性環(huán)境中發(fā)生降解釋放出攜帶的目的基因。因此，納米羥基磷灰石可以作為一種新型的無機(jī)非病毒癌癥基因治療載體。 本研究中，首次將納米羥基磷灰石顆粒用作介導(dǎo)p53基因轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞的基因治療載體。首先試驗(yàn)設(shè)計(jì)、合成了三種不同粒徑的納米HAp顆粒（L-HAp，M-HAp，S-HAp），平均粒徑分別為3.8μm，141nm，39nm。該三種顆粒均為球型，且表面電位相同。其次，將反轉(zhuǎn)錄得到的p53基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體pEGFP-C1（表達(dá)綠色熒光蛋白）上，構(gòu)成重組質(zhì)粒pEGFP-C1-p53（表達(dá)GFP-P53融合蛋白）。然后，將上述兩者在一定條件下溫浴、復(fù)合形成HAp-pEGFP-C1-p53復(fù)合物。最后，，分別體外轉(zhuǎn)染人癌細(xì)胞A549，Huh7，HeLa和人正常細(xì)胞QSG-7701，Beas-2B，從細(xì)胞生物學(xué)水平評(píng)價(jià)納米HAp顆粒作為癌癥基因治療載體的安全性和有效性。 本試驗(yàn)中合成的三種不同粒徑的納米HAp顆粒均能介導(dǎo)p53基因轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞，表達(dá)相應(yīng)的蛋白。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示納米HAp顆�？梢赞D(zhuǎn)染5%-10%的癌細(xì)胞；而轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞的效率約為0.5%，即幾乎不能轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞或轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞后幾乎不能表達(dá)GFP-P53融合蛋白；其中M-HAp的轉(zhuǎn)染效率略高于L-HAp和S-HAp。HAp-pEGFP-C1-p53復(fù)合物轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞后可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效果達(dá)到80%以上。MTT實(shí)驗(yàn)和結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，納米HAp顆粒對(duì)正常細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性，具有較好的生物相容性。綜上結(jié)果，本研究為納米HAp顆粒作為安全有效的無機(jī)非病毒基因治療載體系統(tǒng)和進(jìn)一步完善基因載體設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:Hydroxyapatite is a calcium phosphate compound consisting of calcium ions, phosphate ions and hydroxyl groups. The molecular formula is Ca_ (10) (OH) _2 (PO_4) _6. It is the main component of the natural bone and teeth. Hydroxyapatite has a good bioactivity and biocompatibility. There is no toxic side effect on normal cells. Nanoparticles enter cells through cell phagocytosis; at the same time, hydroxyapatite particles degrade in the acidic environment of cancer cells to release the target genes. Therefore, nano hydroxyapatite can be used as a new type of inorganic non virus cancer gene therapy carrier.
In this study, nano hydroxyapatite particles were used for the first time as a gene therapy carrier to mediate p53 gene transfection to cancer cells. First, three different particle sizes of nano HAp particles (L-HAp, M-HAp, S-HAp) were synthesized. The average particle size was 3.8 m, 141nm, 39nm., the three particles were all spherical and the surface potential was the same. Second, reverse transcription. The obtained p53 gene was constructed on the eukaryotic expression vector, pEGFP-C1 (expressing green fluorescent protein), and formed a recombinant plasmid pEGFP-C1-p53 (expression of GFP-P53 fusion protein). Then, the above two were bathing under certain conditions to form a HAp-pEGFP-C1-p53 complex. Finally, the transfection of human cancer cells A549, Huh7, HeLa and human normal cells QSG- in vitro, respectively. 7701, Beas-2B, evaluate the safety and efficacy of HAp nanoparticles as a cancer gene therapy vector from the cellular biological level.
In this experiment, three different particle sizes of nano HAp particles can mediate p53 gene transfection to cancer cells and express corresponding proteins. Flow cytometry results show that nano HAp particles can transfect 5%-10% cancer cells, and the efficiency of transfection of normal cells is about 0.5%, that is, it is almost impossible to transfect normal cells or transfect normal cells. The GFP-P53 fusion protein could not be expressed, in which the transfection efficiency of M-HAp was slightly higher than that of L-HAp and S-HAp.HAp-pEGFP-C1-p53 complex transfected to cancer cells. The killing effect on cancer cells was more than 80%.MTT experiments and crystal violet staining results showed that nano HAp particles had no obvious cytotoxicity to normal cells. It has good biocompatibility. In summary, this study provides a theoretical basis for the nano HAp particles as a safe and effective non viral gene therapy carrier system and to further improve the design of gene carrier.

【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R318.08

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1788776