本文選題：硫酸鈣 + 牡蠣殼��； 參考：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：骨缺損和骨不連,依然是現(xiàn)今創(chuàng)傷性骨折治療中,外科整形重建所面臨最棘手的問題之一,“自體移植”和“異體移植”理論上可以達(dá)到最佳的恢復(fù)效果,被認(rèn)為是臨床“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是上述治療方法由于內(nèi)在限制和缺陷,無法達(dá)到臨床的廣泛使用。骨移植由于來源受限,并發(fā)癥繁多,骨免疫因素等,無法大量開展。組織工程是作為一門新興交叉學(xué)科,發(fā)展于20世紀(jì)80年代,定義如下：將工程學(xué)和的生命科學(xué)基本原理技術(shù)結(jié)合,在體外構(gòu)建具有生物功能的人工取代物,用于修復(fù)組織缺損,替代失去功能或衰竭的組織、器官的部分或全部功能。由此,大量的人工骨材料被開發(fā)出來,極佳的生物相容性和骨可替代性使得骨組織工程材料能在臨床廣泛使用。牡蠣殼等海洋生物貝殼類具有資源豐富,結(jié)構(gòu)致密,強度與皮質(zhì)骨相當(dāng),其納米顆粒的形成過程于正常骨形成有相似特點,其中碳酸鈣(CaCO3)成分是95.994%,是一種十分有潛力的骨替代材料。如果將牡蠣殼合成并加工制作成一種組織工程骨材料,將為臨床骨缺損修復(fù)提供一種嶄新的治療手段。骨質(zhì)疏松癥是骨科一種常見的全身性骨病,以骨質(zhì)量損害,骨量減少及骨強度變低,最終導(dǎo)致骨脆性增加,發(fā)生脆性骨折為特性。主要的臨床表現(xiàn)：周身疼痛,身高降低、發(fā)生脆性骨折、駝背以及對呼吸系統(tǒng)影響。骨質(zhì)疏松癥對現(xiàn)今醫(yī)療系統(tǒng)負(fù)擔(dān)巨大,在分子水平,骨質(zhì)疏松癥伴隨著成骨功能下降和破骨水平升高。在老年人中,骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為一項主要的健康問題,確診之后的后續(xù)治療也是在不斷調(diào)整。對于骨質(zhì)疏松癥中,關(guān)于骨轉(zhuǎn)化和病理機制,越來越多的研究在開展,同時也使得相應(yīng)的精確靶點治療成為可能。Rab5作為鳥苷酸-5-三磷酸鹽(GTP)結(jié)合蛋白家族中的一員,在早期的細(xì)胞運動內(nèi)吞作用過程,核內(nèi)體的細(xì)胞運輸和成熟過程中,都起到關(guān)鍵性的作用。在人類細(xì)胞中,Rab5有三種不同的亞型存在(RAB5A, Rab5B和Rab5C)三種亞型之間存在重疊的胞內(nèi)定位和細(xì)胞內(nèi)吞功能的重疊。Rab5的主要定位于早期的內(nèi)涵體,調(diào)控細(xì)胞的融合,對接和微管運動。有活性的GTP結(jié)合形式下,下游效應(yīng)器(APPL1和APPL2)被結(jié)合,這次結(jié)合是區(qū)別早期內(nèi)涵體和調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)-運輸貨物的重要標(biāo)志。在本次研究中,探究了Rab5蛋白參與骨系分化和骨重建過程,并在成骨骨骼生長中起到關(guān)鍵作用。本人博士期間從事骨組織工程材料和骨系成骨分化相關(guān)研究。已經(jīng)有多篇SCI論文發(fā)表。本課題分為四個部分：一、牡蠣殼組織工程骨材料制備和特性；二、牡蠣殼組織工程骨材料生物學(xué)研究；三、Rab5在骨系分化中的作用。四、Rab5敲降/過表達(dá)對骨系分化的影響。我們的研究表明,牡蠣殼復(fù)合硫酸鈣材料可以通過改良乙醇鹽溶法成功制取,復(fù)合工程骨可彌補單純硫酸鈣骨誘導(dǎo)性缺乏的劣勢,早期就能形成碳化羥基磷灰石；復(fù)合材料生物相容性佳,促進(jìn)細(xì)胞增殖和成骨基因的表達(dá),股骨缺損修復(fù)實驗效果明顯；Rab5在隨著成骨分化過程表達(dá)上升,臨床骨質(zhì)疏松癥標(biāo)本證實了這一現(xiàn)象；Rab5過表達(dá)促進(jìn)成骨系分化,而siRNA敲降后抑制了成骨系分化,小鼠顱蓋骨體內(nèi)siRNA注射抑制實驗證實Rab5在成骨發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用。第一部分：牡蠣殼組織工程骨制備和特性目的：本實驗?zāi)康氖侵苽淙碌纳锝M織工程骨材料—硫酸鈣／牡蠣殼(CS/OS)。探究本材料的微觀結(jié)構(gòu),自固化性能,物相構(gòu)成,力學(xué)特性,體外降解性和體外生物活性。方法：復(fù)合材料CS/OS的制備和初步性能檢測：使用乙醇鹽溶法制備組織工程骨材料—硫酸鈣/牡蠣殼。鹽溶法制備體系中包括：30%氯化鈣,0.25%的丁二酸,乙醇/水比為2：3的水溶液。通過x射線衍射(XRD)檢測復(fù)合材料的物相信息,場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)觀察復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu)。在加水自固化過程中,我們分別檢測各個樣品的自固化時間,并根據(jù)養(yǎng)護(hù)時間點,測試各組力學(xué)性能差異。將不同組分工程材料放入人體模擬液(SBF),7天后,運用X射線衍射XRD檢測浸潤后材料物相,使用帶有射線能譜(EDX)功能的場發(fā)射掃描電鏡FE-SEM檢測物質(zhì)形貌并進(jìn)行元素分析。將工程材料制成高3mm直徑6mm的圓柱體(Φ6mm×3mm),放置于人體模擬液SBF中水浴,統(tǒng)計每組材料浸泡前后損失的重量。同時通過檢測各個時間點pH值和Ca2+的濃度,對材料降解周圍的微環(huán)境進(jìn)行評估。結(jié)果：實驗探究了材料的自固化性能,力學(xué)特性和體外降解速率。本實驗得到如下的結(jié)果：相比較純半水硫酸鈣骨水泥CS,復(fù)合工程材料硫酸鈣／牡蠣殼粉CS/OS自固化時間相對延長11-28分鐘。隨著養(yǎng)護(hù)時間的延長,CS/OS工程材料力學(xué)性能在初始凝固之后呈現(xiàn)上升趨勢,其中復(fù)合工程材料CS/OS 12力學(xué)性能最佳。牡蠣殼的添加使純半水硫酸鈣CS具備了體外生物活性,在人體模擬液SBF浸泡7天后,CS/OS材料表面產(chǎn)生了碳素類骨羥基磷灰石,此類羥基磷灰石是最適宜人體成骨的礦物質(zhì)。另外,相比純半水硫酸鈣,復(fù)合材料CS/OS的體外降解速率下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,對于解決臨床硫酸鈣使用過程中降解過快,具有一定的意義。結(jié)論：本實驗使用乙醇鹽溶液法成功制取牡蠣殼-硫酸鈣CS/OS骨組織工程材料,制備得到的牡蠣殼工程材料相比純半水硫酸鈣具有更優(yōu)良的骨修復(fù)材料特性。表現(xiàn)在更佳的降解速率和生物活性獲得。為臨床骨修復(fù)材料制備提供了一種新思路。第二部分：牡蠣殼組織工程骨生物學(xué)研究目的：通過使用材料的浸提液和細(xì)胞共培養(yǎng),探究材料對體外細(xì)胞增殖和成骨分化的作用。通過股骨髁缺損模型,植入牡蠣殼組織工程骨,評價其骨修復(fù)能力。方法：MG63細(xì)胞系進(jìn)行體外相容性實驗。材料浸提液培養(yǎng)MG63細(xì)胞后,使用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)方法,檢測細(xì)胞的增殖情況并評估材料的體外相容性。并行堿性磷酸酶染色(ALP染色)和鈣結(jié)節(jié)染色(Von Kossa染色)。蛋白質(zhì)印跡分析(WB),在7,14天時同時檢測Ⅰ型膠原(COLI)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)。采用原位股骨髁缺損實驗,來評估CS/OS復(fù)合材料的骨修復(fù)再生效果。結(jié)果：細(xì)胞增殖實驗中,牡蠣殼工程材料CS/OS浸提液處理細(xì)胞組尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的毒性作用,一定濃度內(nèi)可促進(jìn)細(xì)胞增殖。ALP染色和Von Kossa染色實驗,牡蠣殼工程材料組顯示陽性。兩個指標(biāo)BMP-2和COL Ⅰ,通過蛋白質(zhì)印跡分析WB實驗比較,牡蠣殼工程材料組相比較單純硫酸鈣組蛋白明顯的上調(diào),有統(tǒng)計學(xué)差異。qPCR發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)基因表達(dá)在牡蠣殼材料組明顯上調(diào),如BMP-2,Runx2,Osx, and OCN。股骨髁修復(fù)實驗中,牡蠣殼工程材料組形成的新骨,骨小梁體積更規(guī)則致密,骨髓腔清晰完整。單純硫酸鈣組新骨骨小梁稀疏。結(jié)論：牡蠣殼復(fù)合工程材料具有優(yōu)良的生物相容性,可誘導(dǎo)成骨分化,同時促進(jìn)成骨相關(guān)蛋白BMP-2和COL Ⅰ的表達(dá)。體內(nèi)骨修復(fù)實驗也證實了牡蠣殼工程材料良好的骨修復(fù)能力。第三部分：Rab5在骨系分化中的作用目的：本研究目的旨在探究Rab5在骨質(zhì)疏松中成骨分化的作用,應(yīng)用臨床標(biāo)本和成骨細(xì)胞分化模型,觀察Rab5表達(dá)情況以及成骨相關(guān)基因動態(tài)變化。方法：收集臨床標(biāo)本,不同階段的骨質(zhì)疏松標(biāo)本,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,檢測不同階段骨質(zhì)疏松,Rab5的表達(dá)量變化和病情是否有相關(guān)性。建立成骨分化模型后,檢測成骨相關(guān)特異性基因,1型膠原COL1,骨橋蛋白OPN,骨鈣素OCN,成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2和OSX。并行堿性磷酸酶染色,茜素紅染色和Vonkossa染色。用免疫熒光共聚焦顯徽鏡和蛋白印跡Western Blot方法檢測不同時間點Rab5含量和成骨特異性蛋白變化。結(jié)果：臨床骨質(zhì)疏松病人標(biāo)本的HE病理切片顯示不同的臨床骨松階段,根據(jù)病人臨床資料,骨密度測量值Bone Mineral Density (BMD),觀察到骨小梁規(guī)則和致密程度不同,HE病理提示骨質(zhì)疏松標(biāo)本符合實驗要求。之后對臨床標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,Sp7即Osterix在骨質(zhì)疏松病人中表達(dá)下降,另一方面,Rab5蛋白表達(dá)隨著骨質(zhì)疏松嚴(yán)重程度下調(diào)。MC3T3成骨階段性染色ALP, Alizarin Red和Vonkossa證實成骨模型成功建立。在成骨分化1,3,7,10,14,17和21天時,1型膠原COL1,骨橋蛋白OPN,骨鈣素OCN,成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2和OSX隨著成骨分化進(jìn)行上調(diào),Rab5和其效應(yīng)蛋白APPL1、APPL2也表現(xiàn)出上調(diào)趨勢。免疫熒光共聚焦的結(jié)果也于上述一致。結(jié)論：Rab5和骨質(zhì)疏松癥存在相關(guān)性,Rab5和其效應(yīng)蛋白APPL1,APPL2的上調(diào)在MC3T3成骨分化過程中起到關(guān)鍵作用。第四部分：Rab5的敲降/過表達(dá)對骨系分化的影響目的：通過siRNA敲降Rab5表達(dá),觀察敲降之后對成骨分化的影響。構(gòu)建Rab5過表達(dá)質(zhì)粒,觀察過表達(dá)Rab5對成骨分化影響。小鼠顱蓋骨內(nèi)注射siRNA,觀察Rab5抑制后對骨發(fā)育的影響。方法：設(shè)計siRNA,使用siRNA敲降Rab5蛋白,之后開始成骨分化,檢測成骨相關(guān)Marker的變化,1型膠原COL1,骨橋蛋白OPN,骨鈣素OCN,成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2和OSX。并在相應(yīng)時間點進(jìn)行堿性磷酸酶染色,茜素紅染色和Vonkossa染色。構(gòu)建PXJ-40載體的Rab5過表達(dá)質(zhì)粒。通過瞬轉(zhuǎn)導(dǎo)入質(zhì)粒,觀察過表達(dá)Rab5蛋白之后,對成骨分化的影響。設(shè)計體內(nèi)siRNA,繁殖C57小鼠,對剛出生幼鼠Day2,注射siRNA并在相應(yīng)時間點取材,使用MicroCT觀察小鼠顱蓋骨骨發(fā)育情況。并用鈣黃素進(jìn)行組織學(xué)染色,闡明在體內(nèi)Rab5被敲降之后對成骨過程和骨發(fā)育的影響。結(jié)果：Rab5a、Rab5c在siRNA敲降實驗中下降明顯,敲降之后開始進(jìn)行成骨分化,在4,7天時,一型膠原COL1和轉(zhuǎn)錄因子Runx2下調(diào),同時磷酸化-AKT也出現(xiàn)下調(diào)。過表達(dá)Rab5a、Rab5c質(zhì)粒,瞬轉(zhuǎn)并開始成骨分化,OSX成骨轉(zhuǎn)錄因子出現(xiàn)上調(diào),一些其他的成骨指標(biāo)也維持在較高水平。敲降Rab5的下游效應(yīng)蛋白APPL1、APPL2也出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。7天的時候?qū)ab5過表達(dá)／敲降的細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色,siRNA敲降Rab5a、5c之后ALP染色陰性細(xì)胞率明顯上升。21天進(jìn)行的茜素紅染色和Vonkossa染色在Rab5過表達(dá)／敲降過程中均沒有出現(xiàn)明顯變化。小鼠顱蓋骨siRNA注射之后,鈣黃素染色結(jié)果顯示Rab5a,Rab5c印制組,骨形成速率減慢。從MicroCT結(jié)果顯示,小鼠顱蓋骨骨縫明顯加大,部分區(qū)域可見大片顱蓋骨缺損。結(jié)論：Rab5對于骨系分化是必須的,骨系分化過程中Rab5上調(diào),敲降Rab5會導(dǎo)致成骨分化障礙。體內(nèi)小鼠顱蓋骨敲降實驗也證實了Rab5的缺失會造成體內(nèi)骨發(fā)育障礙。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R687

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙玉英;魏鳳華;王穎莉;;牡蠣殼與煅制牡蠣殼化學(xué)成分的比較研究[J];中國實驗方劑學(xué)雜志;2014年12期

2 李小敏;“益智海味”話牡蠣[J];養(yǎng)生月刊;2001年06期

3 邢湘臣;;中藥瑰寶——牡蠣[J];家庭中醫(yī)藥;2006年11期

4 陳繼培;秋冬牡蠣鮮[J];藥膳食療;2001年05期

5 李振威;謝麗麗;曹陽;王璐萍;孔令妍;薛恩興;彭磊;;天然牡蠣殼納米體復(fù)合型骨材料修復(fù)橈骨缺損的研究[J];實用骨科雜志;2012年09期

6 尹淑敏，李鳳謙;牡蠣的藥用[J];中國藥學(xué)雜志;1994年12期

7 薛恩興;徐華梓;彭磊;;牡蠣殼材料填充兔股骨骨缺損的實驗研究[J];浙江創(chuàng)傷外科;2009年05期

8 陳繼英;;海中牛奶——牡蠣[J];現(xiàn)代養(yǎng)生;2013年07期

9 秋榕;牡蠣美容古今談[J];飲食與健康;1995年02期

10 周森麟,葛福平,朱列偉,沈剛,張泓,周黎;復(fù)方牡蠣補鈣劑的動物實驗研究[J];中國醫(yī)藥學(xué)報;1998年06期

相關(guān)會議論文 前3條

1 全為民;王云龍;;底物類型對牡蠣幼體補充、成活率和種群建成的影響[A];漁業(yè)科技創(chuàng)新與發(fā)展方式轉(zhuǎn)變——2011年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

2 王浩;宋文東;;牡蠣殼對重金屬的吸附研究[A];中國化學(xué)會第26屆學(xué)術(shù)年會綠色化學(xué)分會場論文集[C];2008年

3 熊小京;申茜;;A/O牡蠣殼填料生物濾池中缺氧除磷特性[A];中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會2009年學(xué)術(shù)年會論文集（第二卷）[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 薛敏靈 王任藝 藍(lán)智偉;"霞美牡蠣"走俏港澳臺[N];中國漁業(yè)報;2006年

2 李水瑤;物種增多 養(yǎng)殖牡蠣被失蹤[N];中國漁業(yè)報;2010年

3 胡龍成;海鮮之王牡蠣[N];中國海洋報;2000年

4 本報記者 劉瑾　通訊員 劉國賢 任現(xiàn)輝;乳山牡蠣：“秋播春收”解難題[N];經(jīng)濟(jì)日報;2011年

5 記者 梁思奇;牡蠣殼資源變廢為寶[N];經(jīng)濟(jì)參考報;2002年

6 廣東省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站 顏遠(yuǎn)義;牡蠣的病蟲防治[N];廣東科技報;2003年

7 本報記者 王志強　通訊員 王宇;減產(chǎn)價躥高 牡蠣變“金貴”[N];威海日報;2011年

8 王健康;牧蠣含鋅高 常吃益健康[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2006年

9 實習(xí)生 袁會;貝殼“變身”海珍礁[N];科技日報;2009年

10 副主任醫(yī)師 胡獻(xiàn)國;鋅王牡蠣[N];中國醫(yī)藥報;2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 沈躍;牡蠣殼組織工程骨材料制備和Rab5在骨系分化中的實驗研究[D];浙江大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張聰;褶牡蠣對重金屬的富集與釋放規(guī)律及相關(guān)安全限量研究[D];上海海洋大學(xué);2012年

2 譚雯文;牡蠣綜合利用的研究[D];廣西大學(xué);2006年

3 黃艷;牡蠣殼廢水凈化除磷材料的研制[D];福州大學(xué);2010年

4 吳鋒;牡蠣殼超微粉/聚丙烯（PP）復(fù)合材料制備及其性能研究[D];浙江工業(yè)大學(xué);2012年

5 雷永漢;改性牡蠣殼材料去除Cr(Ⅵ)離子的研究[D];福州大學(xué);2011年

6 徐潔;牡蠣殼曝氣生物濾池處理含氨海水中硝化菌的馴化過程研究[D];廈門大學(xué);2014年

7 李文鵬;改性牡蠣殼除磷吸附劑制備及其除磷性能研究[D];大連理工大學(xué);2014年

8 胡利芳;湛江灣海域養(yǎng)殖牡蠣的重金屬富集及食用安全性分析[D];廣東海洋大學(xué);2011年

9 李玉;牡蠣殼生物載體的制備及在生物濾器工藝中的應(yīng)用[D];華僑大學(xué);2014年

10 劉文;牡蠣加工下腳料綜合利用的關(guān)鍵技術(shù)研究[D];寧波大學(xué);2013年

，

本文編號：1763932