本文選題：前交叉韌帶 + 蠶絲-膠原支架　； 參考：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景前交叉韌帶(anterior cruciate ligament, ACL)是維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu),ACL損傷是運動醫(yī)學(xué)科常見的膝關(guān)節(jié)損傷性疾病,如不及時治療,容易引起膝關(guān)節(jié)的半月板、韌帶、關(guān)節(jié)軟骨等的繼發(fā)性損傷,膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定導(dǎo)致軟骨磨損加快,甚至導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。目前,對于ACL撕裂的治療主要是通過重建手術(shù)恢復(fù)膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定,而用于ACL重建的移植物主要有自體肌腱、同種異體肌腱和人工合成移植材料,但這些材料都存在一定的缺陷。比如自體肌腱移植會加重患者損傷、手術(shù)時間延長,術(shù)后造成取材肌腱的功能喪失、康復(fù)時間延長等；異體肌腱移植主要面臨著宿主抗移植物免疫反應(yīng)、可能會使受體有感染傳染性疾病的風(fēng)險,另外其來源困難也是一個需要考慮的問題；人工合成移植材料短期內(nèi)療效較好,但遠期效果仍面臨著韌帶松弛、力學(xué)強度下降、宿主免疫反應(yīng)引起滑膜炎等問題。理想的ACL替代材料應(yīng)該既能在關(guān)節(jié)腔內(nèi)進行韌帶再生,同時植入骨隧道的兩端又能與骨形成良好的腱-骨界面。近年來隨著組織工程的不斷發(fā)展,為制作理想ACL替代材料創(chuàng)造了可能。膠原是肌腱組織的重要組分,因其良好的生物相容性、能為干細胞提供良好的支持而最先被研究,但提取膠原的力學(xué)性能太差,難以提供有效的力學(xué)支持；脫膠蠶絲具有良好的力學(xué)性能和生物相容性,但其光滑的表面難以為細胞粘附提供條件。將蠶絲和膠原兩種生物材料進行交聯(lián),既能獲得足夠的力學(xué)強度,又能為干細胞粘附提供支持。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)因取材方便、體外擴增快、具有多向誘導(dǎo)分化能力而被廣泛應(yīng)用于組織工程中,是理想的種子細胞。轉(zhuǎn)化生長因子-β3 (transforming growth factor-β3, TGF-P3)是一種具有多種調(diào)節(jié)功能的生長因子,既能調(diào)控軟骨和骨的再生過程,又能調(diào)控細胞外基質(zhì)的分泌、減少組織再生過程中的瘢痕形成,因此是一種理想的調(diào)控組織工程ACL的細胞生長因子。局部單純應(yīng)用生長因子往往會因其在體內(nèi)的半衰期短而需要多次反復(fù)應(yīng)用或單次大劑量應(yīng)用才能達到有效濃度,而將生長因子基因轉(zhuǎn)入到種子細胞,使生長因子在作用部位持續(xù)表達則解決了這一問題�；谝陨涎芯窟M展,本課題主要從幾個方面進行了研究：(1)兔BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定；TGFβ3-Lentivirus慢病毒的構(gòu)建；過表達TGF-β3的BMSCs細胞系的構(gòu)建及鑒定；(2)蠶絲-膠原支架的制備及其生物學(xué)性能檢測；(3)蠶絲-膠原支架聯(lián)合轉(zhuǎn)染TGF-β3基因的BMSCs用于兔ACL重建的實驗研究；(4)對蠶絲-膠原支架進行改進,將羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)負載于蠶絲-膠原支架兩端,用于兔ACL重建的實驗研究。第一部分兔BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定；TGFβ3-Lentivirus慢病毒的構(gòu)建；過表達TGF-P3的BMSCs細胞系的構(gòu)建及鑒定目的分離、培養(yǎng)兔BMSCs,通過流式細胞學(xué)技術(shù)和三系分化能力鑒定其干細胞特性；構(gòu)建攜帶TGF-β3基因的慢病毒載體,對BMSCs進行轉(zhuǎn)染,建立穩(wěn)定表達TGF-β3的BMSCs細胞系。方法我們通過骨髓腔沖洗、貼壁細胞培養(yǎng)的方法獲取兔BMSCs,通過細胞形態(tài)、流式細胞學(xué)和三系誘導(dǎo)分化對分離培養(yǎng)的BMSCs進行鑒定。構(gòu)建攜帶TGF-p3基因,通過感染293T細胞進行病毒顆粒收集,經(jīng)過病毒滴度、最佳MOI測定后用TGFp3-Lentivirus感染BMSCs,用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測TGF-β3基因在BMSCs中的表達,構(gòu)建穩(wěn)定表達TGF-β3的BMSCs細胞系。結(jié)果流式細胞學(xué)和三系分化檢測,我們培養(yǎng)的骨髓腔沖洗液貼壁培養(yǎng)細胞為BMSCs;通過構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞得到了病毒滴度為4.85×108TU/ml的病毒液,而病毒在MOI為200時對兔BMSCs的轉(zhuǎn)染效率可達100%；通過RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TGF-β3在穩(wěn)轉(zhuǎn)的BMSCs細胞系中過表達。結(jié)論通過骨髓沖洗液貼壁培養(yǎng)獲取的兔BMSCs具有干細胞特征和多向分化能力；構(gòu)建的TGF-β3基因慢病毒載體在轉(zhuǎn)染BMSCs后能穩(wěn)定表達,建立了穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。第二部分蠶絲-膠原支架的制備及其生物學(xué)性能檢測目的制備蠶絲-膠原支架并對其生物學(xué)性能進行分析。方法通過乙酸抽提的方法從豬跟腱中獲取I型膠原,用Na2CO3溶液水浴法對生蠶絲網(wǎng)片進行脫膠,將膠原溶液和脫膠蠶絲網(wǎng)片通過冷凍干燥和真空熱交聯(lián)法進行交聯(lián),制作蠶絲-膠原支架材料。用Instron萬能拉力機對生蠶絲網(wǎng)片、脫膠蠶絲以及蠶絲-膠原支架進行生物力學(xué)測定。將BMSCs與蠶絲-膠原支架進行共培養(yǎng),用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察支架表面細胞的形態(tài)。結(jié)果蠶絲網(wǎng)片在脫膠前后及整合膠原后,其力學(xué)性能(最大拉力和剛度)無明顯變化；BMSCs與蠶絲-膠原支架進行共培養(yǎng)后仍保持著梭形,細胞狀態(tài)良好。結(jié)論脫膠、整合膠原等過程未對蠶絲力學(xué)性能造成影響,整合膠原后支架表面形成了多孔、粗糙的表面,更有利于細胞的粘附和生長。第三部分蠶絲-膠原支架聯(lián)合轉(zhuǎn)染TGF-P3基因的BMSCs用于兔ACL重建的實驗研究目的將轉(zhuǎn)染TGF-p3基因的BMSCs種植于蠶絲-膠原支架上,觀察其用于兔ACL重建后關(guān)節(jié)腔內(nèi)韌帶再生和兩端腱-骨愈合的情況。方法40只12周齡新西蘭大白兔,隨機平均分為4組進行雙側(cè)ACL重建：Auto組,以自體半腱肌肌腱重建ACL; S組,以單純蠶絲-膠原支架重建ACL; S+C組,以BMSCs(轉(zhuǎn)染GFP-Lentivirus,并穩(wěn)定表達GFP)種植于蠶絲-膠原支架后用于ACL重建；S+C-T組,轉(zhuǎn)染TGF-03基因的BMSCs種植于蠶絲-膠原支架后用于ACL重建。術(shù)后2周、4周對實驗動物的膝關(guān)節(jié)活動度(ROM)進行測量,術(shù)后2周對膝關(guān)節(jié)進行MRI掃描,觀察關(guān)節(jié)腔內(nèi)術(shù)后情況；術(shù)后4周、16周兩個時間點分別隨機處死每組實驗動物的一半,每組標(biāo)本中的5個進行組織學(xué)檢測,包括關(guān)節(jié)腔內(nèi)韌帶的組織學(xué)檢測和骨隧道腱-骨愈合情況的組織學(xué)監(jiān)測；每組中余下5個標(biāo)本進行micro-CT和生物力學(xué)檢測。結(jié)果術(shù)后第2周,S組、S+C組、S+C-T組兔膝關(guān)節(jié)ROM明顯優(yōu)于Auto組；而第4周時,各組間ROM未見明顯差異。MRI顯示蠶絲-膠原支架在體內(nèi)水分明顯較自體韌帶多。HE和免疫組織化學(xué)染色顯示S+C-T組在16周時有更好的細胞排列和細胞外基質(zhì)沉積；Russell-Movat染色顯示S+C-T組在16周時腱-骨界面形成了典型的生理性腱-骨界面的四層結(jié)構(gòu),而S組和S+C組在腱-骨界面多形成伸入移植物的硬化骨小梁,而Auto組在腱-骨界面則觀察到了典型的Sharpey's纖維。Micro-CT顯示感興趣區(qū)域(area of interesting, AOI)在4周和16周的骨形成指標(biāo)(BV/TV, BMD)均顯著高于Auto組,這和生物力學(xué)結(jié)果相一致。結(jié)論轉(zhuǎn)染TGF-β3基因的BMSCs種植于蠶絲-膠原支架后用于兔ACL重建,不僅能獲得較好的關(guān)節(jié)腔內(nèi)韌帶再生,同時能夠達到良好的腱-骨愈合效果。第四部分兩端負載羥基磷灰石的蠶絲-膠原支架用于兔ACL重建的實驗研究目的用模擬體液結(jié)晶法將HA結(jié)合到蠶絲網(wǎng)片上,將兩端負載HA的蠶絲-膠原支架用于兔ACL重建的實驗研究,觀察其腱-骨界面的愈合情況。方法用模擬體液結(jié)晶法將HA結(jié)合到蠶絲網(wǎng)片上,然后將網(wǎng)片和膠原溶液通過冷凍干燥和真空熱交聯(lián)法進行交聯(lián),制作兩端負載HA的蠶絲-膠原支架材料。24只新西蘭大白兔,隨機平均分為2組進行左側(cè)下肢ACL重建：S組,單純蠶絲-膠原支架用于ACL重建；HA組,兩端負載HA的蠶絲-膠原支架用于ACL重建。術(shù)后16周處死實驗動物,收集標(biāo)本,對ACL的遠期效果進行評價：每組中6個標(biāo)本進行HE和蕃紅-O和免疫組織化學(xué)染色對腱-骨愈合進行評價；剩余6個標(biāo)本進行micro-CT、生物力學(xué)以檢測以及骨性關(guān)節(jié)程度的評分。結(jié)果術(shù)后第16周,組織學(xué)染色顯示S組和HA組腱-骨界面可見骨小梁長入移植物內(nèi),而在HA組骨小梁長入更為明顯,micro-CT矢狀面上顯示骨隧道內(nèi)部有條狀骨形成；免疫組化顯示HA組在腱-骨界面有更多的collagen Ⅰ和osteocalcin的表達,而S組有更多collagen Ⅲ的表達,說明HA組腱-骨界面骨形成更早、更成熟。HA組Micro-CT顯示感興趣區(qū)域的骨形成指標(biāo)(BV/TV, BMD)均顯著高于S組,與生物力學(xué)結(jié)果相一致。對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎評價結(jié)果顯示HA組Mankin評分明顯小于S組,進一步說明HA組ACL重建后膝關(guān)節(jié)較S組重建后更為穩(wěn)定。結(jié)論兩端負載HA的蠶絲-膠原支架用于ACL重建后雖未在腱-骨界面觀察到典型的生理性腱-骨界面結(jié)構(gòu),但HA能在骨隧道內(nèi)誘導(dǎo)骨長入移植物內(nèi)從而形成穩(wěn)定的腱-骨界面,對關(guān)節(jié)軟骨的保護作用優(yōu)于S組的蠶絲-膠原支架。植入過程較為簡單,比蠶絲-膠原支架聯(lián)合轉(zhuǎn)染TGF-β3基因的BMSCs用于ACL重建更具有可操作性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08;R687

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本文編號：1755280