發(fā)布時(shí)間：2018-04-15 18:30

  本文選題：前交叉韌帶 + 蠶絲-膠原支架��； 參考：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景前交叉韌帶(anterior cruciate ligament, ACL)是維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu),ACL損傷是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科常見(jiàn)的膝關(guān)節(jié)損傷性疾病,如不及時(shí)治療,容易引起膝關(guān)節(jié)的半月板、韌帶、關(guān)節(jié)軟骨等的繼發(fā)性損傷,膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定導(dǎo)致軟骨磨損加快,甚至導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。目前,對(duì)于ACL撕裂的治療主要是通過(guò)重建手術(shù)恢復(fù)膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定,而用于ACL重建的移植物主要有自體肌腱、同種異體肌腱和人工合成移植材料,但這些材料都存在一定的缺陷。比如自體肌腱移植會(huì)加重患者損傷、手術(shù)時(shí)間延長(zhǎng),術(shù)后造成取材肌腱的功能喪失、康復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)等；異體肌腱移植主要面臨著宿主抗移植物免疫反應(yīng)、可能會(huì)使受體有感染傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn),另外其來(lái)源困難也是一個(gè)需要考慮的問(wèn)題；人工合成移植材料短期內(nèi)療效較好,但遠(yuǎn)期效果仍面臨著韌帶松弛、力學(xué)強(qiáng)度下降、宿主免疫反應(yīng)引起滑膜炎等問(wèn)題。理想的ACL替代材料應(yīng)該既能在關(guān)節(jié)腔內(nèi)進(jìn)行韌帶再生,同時(shí)植入骨隧道的兩端又能與骨形成良好的腱-骨界面。近年來(lái)隨著組織工程的不斷發(fā)展,為制作理想ACL替代材料創(chuàng)造了可能。膠原是肌腱組織的重要組分,因其良好的生物相容性、能為干細(xì)胞提供良好的支持而最先被研究,但提取膠原的力學(xué)性能太差,難以提供有效的力學(xué)支持；脫膠蠶絲具有良好的力學(xué)性能和生物相容性,但其光滑的表面難以為細(xì)胞粘附提供條件。將蠶絲和膠原兩種生物材料進(jìn)行交聯(lián),既能獲得足夠的力學(xué)強(qiáng)度,又能為干細(xì)胞粘附提供支持。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)因取材方便、體外擴(kuò)增快、具有多向誘導(dǎo)分化能力而被廣泛應(yīng)用于組織工程中,是理想的種子細(xì)胞。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3 (transforming growth factor-β3, TGF-P3)是一種具有多種調(diào)節(jié)功能的生長(zhǎng)因子,既能調(diào)控軟骨和骨的再生過(guò)程,又能調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、減少組織再生過(guò)程中的瘢痕形成,因此是一種理想的調(diào)控組織工程ACL的細(xì)胞生長(zhǎng)因子。局部單純應(yīng)用生長(zhǎng)因子往往會(huì)因其在體內(nèi)的半衰期短而需要多次反復(fù)應(yīng)用或單次大劑量應(yīng)用才能達(dá)到有效濃度,而將生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)入到種子細(xì)胞,使生長(zhǎng)因子在作用部位持續(xù)表達(dá)則解決了這一問(wèn)題�；谝陨涎芯窟M(jìn)展,本課題主要從幾個(gè)方面進(jìn)行了研究：(1)兔BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定；TGFβ3-Lentivirus慢病毒的構(gòu)建；過(guò)表達(dá)TGF-β3的BMSCs細(xì)胞系的構(gòu)建及鑒定；(2)蠶絲-膠原支架的制備及其生物學(xué)性能檢測(cè)；(3)蠶絲-膠原支架聯(lián)合轉(zhuǎn)染TGF-β3基因的BMSCs用于兔ACL重建的實(shí)驗(yàn)研究；(4)對(duì)蠶絲-膠原支架進(jìn)行改進(jìn),將羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)負(fù)載于蠶絲-膠原支架兩端,用于兔ACL重建的實(shí)驗(yàn)研究。第一部分兔BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定；TGFβ3-Lentivirus慢病毒的構(gòu)建；過(guò)表達(dá)TGF-P3的BMSCs細(xì)胞系的構(gòu)建及鑒定目的分離、培養(yǎng)兔BMSCs,通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)和三系分化能力鑒定其干細(xì)胞特性；構(gòu)建攜帶TGF-β3基因的慢病毒載體,對(duì)BMSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染,建立穩(wěn)定表達(dá)TGF-β3的BMSCs細(xì)胞系。方法我們通過(guò)骨髓腔沖洗、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的方法獲取兔BMSCs,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞學(xué)和三系誘導(dǎo)分化對(duì)分離培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行鑒定。構(gòu)建攜帶TGF-p3基因,通過(guò)感染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒顆粒收集,經(jīng)過(guò)病毒滴度、最佳MOI測(cè)定后用TGFp3-Lentivirus感染BMSCs,用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)TGF-β3基因在BMSCs中的表達(dá),構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TGF-β3的BMSCs細(xì)胞系。結(jié)果流式細(xì)胞學(xué)和三系分化檢測(cè),我們培養(yǎng)的骨髓腔沖洗液貼壁培養(yǎng)細(xì)胞為BMSCs;通過(guò)構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞得到了病毒滴度為4.85×108TU/ml的病毒液,而病毒在MOI為200時(shí)對(duì)兔BMSCs的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)100%；通過(guò)RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TGF-β3在穩(wěn)轉(zhuǎn)的BMSCs細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)。結(jié)論通過(guò)骨髓沖洗液貼壁培養(yǎng)獲取的兔BMSCs具有干細(xì)胞特征和多向分化能力；構(gòu)建的TGF-β3基因慢病毒載體在轉(zhuǎn)染BMSCs后能穩(wěn)定表達(dá),建立了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。第二部分蠶絲-膠原支架的制備及其生物學(xué)性能檢測(cè)目的制備蠶絲-膠原支架并對(duì)其生物學(xué)性能進(jìn)行分析。方法通過(guò)乙酸抽提的方法從豬跟腱中獲取I型膠原,用Na2CO3溶液水浴法對(duì)生蠶絲網(wǎng)片進(jìn)行脫膠,將膠原溶液和脫膠蠶絲網(wǎng)片通過(guò)冷凍干燥和真空熱交聯(lián)法進(jìn)行交聯(lián),制作蠶絲-膠原支架材料。用Instron萬(wàn)能拉力機(jī)對(duì)生蠶絲網(wǎng)片、脫膠蠶絲以及蠶絲-膠原支架進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)定。將BMSCs與蠶絲-膠原支架進(jìn)行共培養(yǎng),用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察支架表面細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果蠶絲網(wǎng)片在脫膠前后及整合膠原后,其力學(xué)性能(最大拉力和剛度)無(wú)明顯變化；BMSCs與蠶絲-膠原支架進(jìn)行共培養(yǎng)后仍保持著梭形,細(xì)胞狀態(tài)良好。結(jié)論脫膠、整合膠原等過(guò)程未對(duì)蠶絲力學(xué)性能造成影響,整合膠原后支架表面形成了多孔、粗糙的表面,更有利于細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。第三部分蠶絲-膠原支架聯(lián)合轉(zhuǎn)染TGF-P3基因的BMSCs用于兔ACL重建的實(shí)驗(yàn)研究目的將轉(zhuǎn)染TGF-p3基因的BMSCs種植于蠶絲-膠原支架上,觀察其用于兔ACL重建后關(guān)節(jié)腔內(nèi)韌帶再生和兩端腱-骨愈合的情況。方法40只12周齡新西蘭大白兔,隨機(jī)平均分為4組進(jìn)行雙側(cè)ACL重建：Auto組,以自體半腱肌肌腱重建ACL; S組,以單純蠶絲-膠原支架重建ACL; S+C組,以BMSCs(轉(zhuǎn)染GFP-Lentivirus,并穩(wěn)定表達(dá)GFP)種植于蠶絲-膠原支架后用于ACL重建；S+C-T組,轉(zhuǎn)染TGF-03基因的BMSCs種植于蠶絲-膠原支架后用于ACL重建。術(shù)后2周、4周對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度(ROM)進(jìn)行測(cè)量,術(shù)后2周對(duì)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行MRI掃描,觀察關(guān)節(jié)腔內(nèi)術(shù)后情況；術(shù)后4周、16周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)處死每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一半,每組標(biāo)本中的5個(gè)進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè),包括關(guān)節(jié)腔內(nèi)韌帶的組織學(xué)檢測(cè)和骨隧道腱-骨愈合情況的組織學(xué)監(jiān)測(cè)；每組中余下5個(gè)標(biāo)本進(jìn)行micro-CT和生物力學(xué)檢測(cè)。結(jié)果術(shù)后第2周,S組、S+C組、S+C-T組兔膝關(guān)節(jié)ROM明顯優(yōu)于Auto組；而第4周時(shí),各組間ROM未見(jiàn)明顯差異。MRI顯示蠶絲-膠原支架在體內(nèi)水分明顯較自體韌帶多。HE和免疫組織化學(xué)染色顯示S+C-T組在16周時(shí)有更好的細(xì)胞排列和細(xì)胞外基質(zhì)沉積；Russell-Movat染色顯示S+C-T組在16周時(shí)腱-骨界面形成了典型的生理性腱-骨界面的四層結(jié)構(gòu),而S組和S+C組在腱-骨界面多形成伸入移植物的硬化骨小梁,而Auto組在腱-骨界面則觀察到了典型的Sharpey's纖維。Micro-CT顯示感興趣區(qū)域(area of interesting, AOI)在4周和16周的骨形成指標(biāo)(BV/TV, BMD)均顯著高于Auto組,這和生物力學(xué)結(jié)果相一致。結(jié)論轉(zhuǎn)染TGF-β3基因的BMSCs種植于蠶絲-膠原支架后用于兔ACL重建,不僅能獲得較好的關(guān)節(jié)腔內(nèi)韌帶再生,同時(shí)能夠達(dá)到良好的腱-骨愈合效果。第四部分兩端負(fù)載羥基磷灰石的蠶絲-膠原支架用于兔ACL重建的實(shí)驗(yàn)研究目的用模擬體液結(jié)晶法將HA結(jié)合到蠶絲網(wǎng)片上,將兩端負(fù)載HA的蠶絲-膠原支架用于兔ACL重建的實(shí)驗(yàn)研究,觀察其腱-骨界面的愈合情況。方法用模擬體液結(jié)晶法將HA結(jié)合到蠶絲網(wǎng)片上,然后將網(wǎng)片和膠原溶液通過(guò)冷凍干燥和真空熱交聯(lián)法進(jìn)行交聯(lián),制作兩端負(fù)載HA的蠶絲-膠原支架材料。24只新西蘭大白兔,隨機(jī)平均分為2組進(jìn)行左側(cè)下肢ACL重建：S組,單純蠶絲-膠原支架用于ACL重建；HA組,兩端負(fù)載HA的蠶絲-膠原支架用于ACL重建。術(shù)后16周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,收集標(biāo)本,對(duì)ACL的遠(yuǎn)期效果進(jìn)行評(píng)價(jià)：每組中6個(gè)標(biāo)本進(jìn)行HE和蕃紅-O和免疫組織化學(xué)染色對(duì)腱-骨愈合進(jìn)行評(píng)價(jià)；剩余6個(gè)標(biāo)本進(jìn)行micro-CT、生物力學(xué)以檢測(cè)以及骨性關(guān)節(jié)程度的評(píng)分。結(jié)果術(shù)后第16周,組織學(xué)染色顯示S組和HA組腱-骨界面可見(jiàn)骨小梁長(zhǎng)入移植物內(nèi),而在HA組骨小梁長(zhǎng)入更為明顯,micro-CT矢狀面上顯示骨隧道內(nèi)部有條狀骨形成；免疫組化顯示HA組在腱-骨界面有更多的collagen Ⅰ和osteocalcin的表達(dá),而S組有更多collagen Ⅲ的表達(dá),說(shuō)明HA組腱-骨界面骨形成更早、更成熟。HA組Micro-CT顯示感興趣區(qū)域的骨形成指標(biāo)(BV/TV, BMD)均顯著高于S組,與生物力學(xué)結(jié)果相一致。對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎評(píng)價(jià)結(jié)果顯示HA組Mankin評(píng)分明顯小于S組,進(jìn)一步說(shuō)明HA組ACL重建后膝關(guān)節(jié)較S組重建后更為穩(wěn)定。結(jié)論兩端負(fù)載HA的蠶絲-膠原支架用于ACL重建后雖未在腱-骨界面觀察到典型的生理性腱-骨界面結(jié)構(gòu),但HA能在骨隧道內(nèi)誘導(dǎo)骨長(zhǎng)入移植物內(nèi)從而形成穩(wěn)定的腱-骨界面,對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用優(yōu)于S組的蠶絲-膠原支架。植入過(guò)程較為簡(jiǎn)單,比蠶絲-膠原支架聯(lián)合轉(zhuǎn)染TGF-β3基因的BMSCs用于ACL重建更具有可操作性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R318.08;R687

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本文編號(hào)：1755280