本文選題：致密層　切入點(diǎn)：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：由于創(chuàng)傷、疾病等原因，常常導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的缺損，易發(fā)展為骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis OA)，給患者帶來巨大的痛苦。關(guān)節(jié)軟骨無血液供應(yīng)，加之軟骨細(xì)胞為分裂、增殖和代謝不活躍的穩(wěn)定細(xì)胞，因而其自身修復(fù)能力極差。此外，關(guān)節(jié)軟骨全層缺損后，位于其下的軟骨下骨往往會出現(xiàn)退變、硬化等病理改變，而新生軟骨是無法與硬化、退變的軟骨下骨進(jìn)行整合的，故關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)必須考慮同時修復(fù)病變的軟骨下骨。到目前為止，臨床上采用的多種外科治療方法，均未能獲得滿意的治療效果。組織工程技術(shù)的進(jìn)步，給關(guān)節(jié)骨軟骨損傷的修復(fù)再來希望。近十年來，已有部分學(xué)者使用骨支架與軟骨支架的復(fù)合體，來修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨損傷。雖然獲得了部分成功，但仍有兩大問題制約其在臨床上推廣：一，軟骨支架與骨支架之間的結(jié)合力差，在關(guān)節(jié)內(nèi)不能承受各種應(yīng)力，經(jīng)常發(fā)生斷裂現(xiàn)象；二，骨軟骨復(fù)合支架上的種子細(xì)胞的增殖、分化能力差，骨軟骨組織的修復(fù)情況不佳。 要解決以上兩大問題，必須要對骨軟骨的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的生存環(huán)境有個充分的理解。正常關(guān)節(jié)面由軟骨和軟骨下骨構(gòu)成。在微觀結(jié)構(gòu)上，軟骨分四層：淺表層、移行層、柱狀層和鈣化層。鈣化層結(jié)構(gòu)致密，實(shí)質(zhì)上是軟骨與軟骨下骨的過渡層，起著隔離軟骨和軟骨下骨的作用，同時將二者牢固地整合在一起。軟骨營養(yǎng)主要來源于關(guān)節(jié)腔滑液，而關(guān)節(jié)液中的氧濃度明顯低于軟骨下松質(zhì)骨的氧供濃度。軟骨細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境，低氧條件下有利于軟骨細(xì)胞的分化、增殖。如果血液一旦侵入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，其中一些成分會因觸發(fā)炎性反應(yīng)而導(dǎo)致新生軟骨細(xì)胞凋亡或壞死。與此同時，如果關(guān)節(jié)液滲透入軟骨下骨，亦有害于成骨細(xì)胞，嚴(yán)重影響其活性。由此可見，尤其對于修復(fù)能力差的軟骨細(xì)胞來說，鈣化層是維持其良好狀態(tài)必不可少的條件。理想的骨軟骨組織工程支架應(yīng)模擬正常關(guān)節(jié)的骨軟骨結(jié)構(gòu)，在復(fù)合骨軟骨支架中制備相當(dāng)于鈣化層的結(jié)構(gòu)，才能更好地促進(jìn)關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的修復(fù)。 本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中，利用物理粉碎和化學(xué)脫細(xì)胞相結(jié)合的方法，提取了牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)。并采用了溫度梯度熱誘導(dǎo)相分離(temperature gradient-guided thermal-induced phase separation, TIPS)技術(shù)，制備出具有定向微管結(jié)構(gòu)的軟骨支架。以β-磷酸三鈣（tricalcium phosphate, β-TCP）、聚丙交酯-乙交酯共聚物[poly(1actic-co-glycolic acid)， PLGA]（兩者配比7:3）與Ⅰ型膠原作為原材料，采用快速成形(rapid prototyping, RP)技術(shù)和低溫沉積鑄造（low-temperaturedeposition manufacturing, LDM)法，制備了具有三維結(jié)構(gòu)、內(nèi)層為PLGA/β-TCP、表面包裹Ⅰ型膠原的包芯結(jié)構(gòu)骨支架材料。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，此兩種軟骨支架與骨支架具有良好的加工和成型特性、較高的空隙率、優(yōu)秀的親水性和生物相容性、適合的機(jī)械強(qiáng)度和降解速度，能夠滿足骨與軟骨組織工程的理想支架材料的要求。 本實(shí)驗(yàn)?zāi)M鈣化層結(jié)構(gòu)，在軟骨支架與骨支架之間增加了致密層，目的是牢固地將兩者整合起來，以提高骨軟骨復(fù)合支架的機(jī)械力學(xué)性能；同時，希望在骨軟骨復(fù)合支架植入體內(nèi)后，致密層能將軟骨支架和骨支架上結(jié)合的細(xì)胞分隔在關(guān)節(jié)腔和骨髓腔的封閉環(huán)境內(nèi)，以利于種子細(xì)胞分別向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化和增殖，利于骨軟骨組織的修復(fù)。具體的研究內(nèi)容如下： 第一部分具有致密層的骨軟骨復(fù)合支架的制備及致密層特性的研究 本實(shí)驗(yàn)同樣采用快速成型技術(shù)，在骨支架表面噴涂PLGA/β-TCP，形成一厚約0.5mm的致密層。通過“溶解-粘連”工藝，將軟骨支架與致密層相連。這樣，帶有致密層的骨軟骨復(fù)合支架構(gòu)建即可完成。本實(shí)驗(yàn)還制作了沒有致密層的骨軟骨復(fù)合支架，即骨支架與軟骨支架也是通過“溶解-粘連”工藝，直接相連。以具有致密層的骨軟骨復(fù)合支架為實(shí)驗(yàn)組，沒有致密層的為對照組。 使用電子掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）對致密層進(jìn)行觀察，對致密層的孔隙率、吸水率以及液體和細(xì)胞對其通透性進(jìn)行檢測，并對具有致密層和沒有致密層的兩組骨軟骨復(fù)合支架的力學(xué)性能進(jìn)行了檢測和比較。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：致密層的孔隙率、吸水率極小，有較強(qiáng)的疏水性，對液體和細(xì)胞無通透性；實(shí)驗(yàn)組骨軟骨復(fù)合支架的最大抗拉伸力、抗剪切力顯著高于對照組（P0.05）。以上結(jié)果提示：致密層有將軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分隔在不同的環(huán)境中的能力，并且致密層能顯著地增強(qiáng)骨軟骨復(fù)合支架的力學(xué)性能。 第二部分致密層在體外構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合物中作用的研究 本實(shí)驗(yàn)從成年兔髂骨骨髓中提純、擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow stemcells, BMSCs）后，使用不同的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)其分別向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞方向分化。然后將帶致密層的骨軟骨復(fù)合支架置于本課題組自制的骨軟骨培養(yǎng)腔中，通過滴注法，把誘導(dǎo)形成的軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞分別接種于復(fù)合支架的軟骨支架與骨支架上，繼續(xù)使用誘導(dǎo)劑，分別向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)和培養(yǎng)。由于致密層的存在，軟骨支架與骨支架上的細(xì)胞被分隔在不同的環(huán)境中。利用掃描電鏡觀察細(xì)胞在骨軟骨復(fù)合支架內(nèi)粘附的形態(tài)，采取MTT法了解細(xì)胞在支架上增殖的情況，使用多種染色方法檢測BMSCs向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化情況。 SEM觀察可見，在有致密層隔離的條件下，細(xì)胞在支架上伸出長長的偽足，細(xì)胞變成扁平狀并相互接觸、接連成片，深入支架孔隙的深處，完全覆蓋支架孔隙的表面。MTT法檢測結(jié)果可見，隨著培養(yǎng)時間的延長，骨軟骨復(fù)合支架上的細(xì)胞數(shù)量均顯著地升高。細(xì)胞在支架上誘導(dǎo)、培養(yǎng)20d后，將向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的BMSCs分別從支架上消化下來，分別添加軟骨培養(yǎng)基和成骨培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)、誘導(dǎo)24h。向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)的BMSCs使用番紅O、甲苯胺藍(lán)、II型膠原的免疫組化染色，均呈陽性，而I型膠原的免疫組化染色陰性；向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的BMSCs使用BCIP/NBT底物行堿性磷酸酶染色(alkaline phosphatase, ALP)，使用茜素紅法行鈣結(jié)節(jié)染色，均呈陽性。 以上結(jié)果表明，在致密層將軟骨支架和骨支架上的細(xì)胞分隔在兩個不同的培養(yǎng)環(huán)境中后，細(xì)胞能夠在支架上良好地粘附和增殖，顯示典型的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化表型，無退化現(xiàn)象的發(fā)生，在體外可成功構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合物。 第三部分致密層在體內(nèi)修復(fù)兔關(guān)節(jié)骨軟骨缺損中作用的研究 本實(shí)驗(yàn)將結(jié)合經(jīng)誘導(dǎo)的自體BMSCs的骨軟骨復(fù)合支架回植入兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨全層缺損處，于術(shù)后3月和6月分別取材，通過對新生軟骨進(jìn)行大體形態(tài)觀察、壓縮模量和分子生物學(xué)檢測，對新生軟骨下骨進(jìn)行骨礦物質(zhì)密度（bone mineral density,BMD）檢測，以及對新生骨軟骨組織進(jìn)行顯微計算機(jī)斷層掃描(Micro-computedtomography, Micro-CT)三維重建、組織學(xué)染色觀察，驗(yàn)證致密層在體內(nèi)對骨軟骨復(fù)合支架修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨全層缺損的影響。 新生軟骨的大體觀察可見，與對照組軟骨支架比，實(shí)驗(yàn)組軟骨獲得了較為滿意的修復(fù)。實(shí)驗(yàn)組新生軟骨的大體形態(tài)評分結(jié)果、壓縮模量、Ⅱ型膠原及其mRNA的表達(dá)均明顯高于對照組（P0.05），術(shù)后6月，其數(shù)值與正常軟骨支架相比，無顯著差異（P＞0.05）。 新生骨軟骨的組織學(xué)染色可見，實(shí)驗(yàn)組的新生骨軟骨組織的形態(tài)更優(yōu)于對照組，尤其是在術(shù)后6月，接近于正常骨軟骨組織。實(shí)驗(yàn)組新生的骨軟骨的組織評分結(jié)果均顯著高于對照組（P0.05）。此外，Micro-CT三維重建的結(jié)果，與組織學(xué)染色完全吻合。實(shí)驗(yàn)組的新生軟骨下骨的BMD值亦顯著高于對照組。 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對于對照組，實(shí)驗(yàn)組新生骨軟骨組織在形態(tài)學(xué)、生物力學(xué)、分子生物學(xué)方面，均獲得較好的結(jié)果。表明：在體內(nèi)，由于致密層的存在，成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖、分化良好。 因此，，致密層在骨軟骨復(fù)合支架修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨缺損中，具有重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1713867